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微流控芯片技術(shù)應(yīng)對(duì)臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)考驗(yàn)

來源:王輝 瀏覽 1337 次 發(fā)布時(shí)間:2022-11-10

一、微流控與微流控芯片

微流控(Microfluidics)的含義是微尺度下的流體控制,其研究對(duì)象是使用微米級(jí)通道操控納升級(jí)以下微量液體的系統(tǒng)[1-3]。鑒于芯片是實(shí)現(xiàn)微流體控制的主要平臺(tái),因而微流控芯片(Microfluidic chip)是微流控的主要研究內(nèi)容。

微流控芯片的制作主要依托于MEMS(Micro-Electro-Mechanical System)加工工藝,具有在微米尺度級(jí)別實(shí)現(xiàn)微量流體操控的能力。微流控芯片技術(shù)的特點(diǎn)來自于兩個(gè)方面:一是微流體的特性微尺度下流體的一系列特殊效應(yīng)包括層流效應(yīng)、表面張力及毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)效應(yīng)和擴(kuò)散效應(yīng)等,這些效應(yīng)有利于精確流體控制和實(shí)現(xiàn)快速反應(yīng);二是微加工工藝帶來的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性微加工工藝具有加工小尺寸、高密度微結(jié)構(gòu)的能力,便于實(shí)現(xiàn)各種操作單元的靈活組合與規(guī)模集成。因此,樣品前處理、分離與分析、檢測等實(shí)驗(yàn)流程得以在同一芯片上集成化和并行化,從而達(dá)到微型化、自動(dòng)化、低消耗和高效率的目的[4,5]。

微流控研究起始于20世紀(jì)90年代,至今已經(jīng)有二十余年的發(fā)展歷史,其間經(jīng)歷了基礎(chǔ)理論奠定、單元操作技術(shù)發(fā)展、小規(guī)模集成和大規(guī)模集成幾個(gè)歷史發(fā)展階段。至今,微流控技術(shù)已經(jīng)較為成熟,已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域得到認(rèn)可并廣為利用,其產(chǎn)業(yè)化趨勢亦是愈發(fā)明顯[6]。2003年《福布斯》雜志把這項(xiàng)技術(shù)評(píng)為“影響人類未來15件最重要發(fā)明之一”;2004年,美國Business 2.0雜志封面文章將微流控芯片列為“改變世界”的七種技術(shù)之一;2006年Nature雜志出版了一期微流控專輯,題名為“本世紀(jì)的技術(shù)”。


二、微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢

體外診斷(In vitro diagnosis,IVD),是指對(duì)人體的體液和組織等進(jìn)行檢測而獲得臨床診斷信息。微流控芯片是體外診斷的有利技術(shù)平臺(tái)[7,8],這表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1.應(yīng)用場景拓展傳統(tǒng)的檢驗(yàn)設(shè)備多為大型儀器,雖然在測試通量和穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢,但其使用局限于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片系統(tǒng)體積小巧、操作簡單,完全可以在門急診、基層醫(yī)療單位甚至床邊進(jìn)行檢測,這極大地拓展了體外診斷的應(yīng)用空間;2.分析效率的提高集成化和并行化設(shè)計(jì)的微流控芯片系統(tǒng),有能力在短時(shí)間內(nèi)提供更為豐富的診斷信息,因而顯著提升了分析效率;3.測試成本的下降微流控芯片使用微反應(yīng)體系,能夠大幅降低試樣消耗從而降低測試成本[9]。概括來講,微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢可以歸結(jié)為多、快、好、省四個(gè)字,這種分析技術(shù)無疑是對(duì)現(xiàn)有體外診斷技術(shù)的巨大提升。

微流控體外診斷技術(shù)已經(jīng)引起了國家層面的重視。2016年國務(wù)院“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃中關(guān)于體外診斷產(chǎn)品的章節(jié)寫到“突破微流控芯片等關(guān)鍵技術(shù),開發(fā)全自動(dòng)核酸檢測系統(tǒng)等一批重大產(chǎn)品,研發(fā)一批重大疾病早期診斷和精確治療診斷試劑以及適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的高精度診斷產(chǎn)品,提升我國體外診斷產(chǎn)業(yè)競爭力”。由此可見,微流控體外診斷技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)上升到國家戰(zhàn)略層面。

作者所在研究團(tuán)隊(duì)工作于臨床檢驗(yàn)第一線,課題組的研究方向是針對(duì)臨床檢驗(yàn)中的痛點(diǎn)問題發(fā)展創(chuàng)新微流控診斷技術(shù)。經(jīng)歷了十余年的研究歷程,課題組對(duì)于微流控體外診斷技術(shù)在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值逐步加深了理解。本文中就課題組對(duì)于微流控技術(shù)的理解以及我們的一些體外診斷應(yīng)用嘗試與大家分享,希望能夠?qū)z驗(yàn)醫(yī)學(xué)同仁有所幫助。


三、微流控芯片技術(shù)在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用嘗試

當(dāng)前,傳統(tǒng)的體外診斷技術(shù)已經(jīng)極為成熟。微流控體外診斷產(chǎn)品若要進(jìn)入體外診斷市場,勢必要展示出高人一籌的能力。相比較傳統(tǒng)的宏觀檢驗(yàn)設(shè)備,微流控產(chǎn)品最大的市場拓展?jié)摿υ谟冢?.針對(duì)傳統(tǒng)產(chǎn)品無法適用的應(yīng)用環(huán)境開發(fā)產(chǎn)品;2.發(fā)展性能指標(biāo)和操作便利性具有明顯優(yōu)勢的顛覆性新產(chǎn)品。一個(gè)成功的微流控體外診斷產(chǎn)品,需要在操作便利性、分析速度、分析通量和測試成本等幾個(gè)方面達(dá)到平衡。以下,我們就課題組在幾個(gè)關(guān)鍵的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域的研究工作加以介紹。

(一)分子診斷

分子診斷是新興的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。隨著熒光定量PCR的推廣,基因檢測技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。盡管如此,現(xiàn)有核酸分析平臺(tái)的一些不足之處還是限制了分子診斷技術(shù)的推廣:1)場地要求嚴(yán)格,試劑準(zhǔn)備、核酸提取和擴(kuò)增需要分別在獨(dú)立房間內(nèi)進(jìn)行,極大限制了該技術(shù)在醫(yī)療資源有限條件下的開展;2)采用離線式分析,操作復(fù)雜、分析周期較長,不利于應(yīng)對(duì)突發(fā)性事件;3)現(xiàn)有的熒光定量PCR方法多是針對(duì)單一指標(biāo)檢測設(shè)計(jì),對(duì)于多重基因檢測無論是操作繁瑣程度還是測試成本均是難以接受的。

分子診斷是微流控芯片技術(shù)最具有代表性的應(yīng)用領(lǐng)域。對(duì)于分子診斷應(yīng)用,微流控芯片最大的貢獻(xiàn)在于該技術(shù)有潛力將核酸提取、擴(kuò)增和檢測集成于同一裝置,因而可擺脫繁瑣操作以及對(duì)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的依賴。此外,由于反應(yīng)過程處于封閉的環(huán)境中,可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成,微流控核酸分析芯片還需要具有一定的分析通量以滿足臨床實(shí)際需求。已經(jīng)商業(yè)化的微流控分子診斷產(chǎn)品基本都是針對(duì)病原微生物檢測應(yīng)用,其價(jià)值在于:1.實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測;2.解決難于培養(yǎng)鑒定病原(如結(jié)核桿菌、病毒、支原體等)鑒定問題。

作者課題組最近發(fā)展一種液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)[10]。這種便攜式系統(tǒng)包含機(jī)械、磁力和光學(xué)檢測單元,其設(shè)計(jì)理念是平衡集成、通量、成本及便攜性等關(guān)鍵因素,發(fā)展適合于現(xiàn)場應(yīng)用的病原篩查工具。系統(tǒng)所用微流控芯片上設(shè)計(jì)有多組以狹縫通道連通的串聯(lián)微池,全部分析試劑均以油包水形式預(yù)存儲(chǔ)于其中。由于表面張力效應(yīng),油相可以浸潤微池和狹縫而水相不能。利用磁鐵陣列驅(qū)動(dòng)磁珠在串聯(lián)液滴中穿行,程序化完成細(xì)胞裂解-核酸結(jié)合、磁珠洗滌、核酸洗脫、擴(kuò)增/檢測等一系列步驟,從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和平行化核酸分析。該系統(tǒng)極為緊湊,適合于現(xiàn)場快速檢測及醫(yī)院門急診場景下的“隨到隨檢、快速響應(yīng)”需求。課題組將這一系統(tǒng)用于性傳播疾病病原篩查,淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲脲原體、生殖支原體等四種病原的篩查可在45 min內(nèi)完成。

圖1液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)。A.分析儀器實(shí)物及結(jié)構(gòu)示意圖;B.分析原理示意圖。

(二)免疫檢測

免疫檢測是臨床檢驗(yàn)極為重要的領(lǐng)域。目前,臨床免疫檢測的主流技術(shù)是化學(xué)發(fā)光和免疫比濁法,具有靈敏度高和檢測線性范圍寬的優(yōu)勢。這些檢測方法一般使用大型儀器,分析通量較高。但是,由于購置成本和儀器體積因素,這類設(shè)備僅適合于大型實(shí)驗(yàn)室使用。基于試紙條的膠體金法是快速免疫檢測的主流技術(shù),該技術(shù)雖然使用方便,但在靈敏度和線性范圍方面受限。因此,臨床檢驗(yàn)工作需要一種兼具操作便利性、檢測靈敏度和定量準(zhǔn)確性的免疫檢測平臺(tái),這對(duì)于急診以及基層醫(yī)療單位尤其重要。

圖2液滴陣列微流控芯片免疫分析系統(tǒng)。A.分析儀器結(jié)構(gòu)示意圖;B.分析原理示意圖。

作者課題組發(fā)展了一種微流控芯片免疫化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)[10]。與前面介紹的液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)類似,免疫化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)采用具有平行串聯(lián)微池結(jié)構(gòu)的微流控芯片。免疫化學(xué)發(fā)光分析相關(guān)的一組試劑以油包水液滴形式預(yù)存儲(chǔ)于指定微池中。由于表面張力效應(yīng),狹縫可以隔絕水相溶液。通過程序化的磁力操控,在液滴間轉(zhuǎn)移磁珠,從而將化學(xué)發(fā)光免疫分析涉及的一系列操作,包括抗原-抗體結(jié)合、磁珠洗滌、酶促發(fā)光及信號(hào)檢測,在芯片分析系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成。研究利用發(fā)展的微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,進(jìn)行了C反應(yīng)蛋白(CRP)與降鈣素原(PCT)兩種感染性疾病標(biāo)記物的同步檢測。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,整個(gè)過程可在15 min內(nèi)完成。CRP與PCT檢測限分別為0.31 ng?mL-1和0.09 ng?mL-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.8-200 ng?mL-1和0.5-60 ng?mL-1,對(duì)照測試提示微流控芯片系統(tǒng)與商品化儀器檢測結(jié)果高度一致。

(三)病原微生物檢測

病原微生物檢測主要包括病原鑒定和藥物敏感性判定兩個(gè)方面。目前,臨床微生物檢測面臨的最大問題就是檢測周期過長。感染性疾病大多病情兇險(xiǎn),需要及時(shí)診斷和治療,留給病原檢測的時(shí)間窗口只有30分鐘左右。然而,目前的病原微生物鑒定和藥物敏感性判定的典型周期是2-3天,這顯然難以滿足臨床需求。病原檢測技術(shù)的限制所帶來的結(jié)果是,一方面經(jīng)驗(yàn)性診斷的準(zhǔn)確性難于保證,另一方面抗生素濫用引發(fā)了嚴(yán)重的耐藥問題。

微流控技術(shù)對(duì)于病原微生物鑒定的解決方案多是采用核酸檢測策略,這在前面部分已經(jīng)敘述。鑒于藥物敏感性(Antimicrobial Susceptibility Testing,AST)判定的實(shí)質(zhì)是病原在藥物暴露條件下的增殖情況判定,微流控技術(shù)采用的策略是:1.通過培養(yǎng)器體積的減小,實(shí)現(xiàn)檢測信號(hào)的相對(duì)富集;2.使用更為精準(zhǔn)的病原定量技術(shù)。這兩種策略均可以通過縮短病原培養(yǎng)時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速的藥物敏感性判定。遵循這種理念,作者課題組發(fā)展了一種基于液滴陣列微流控芯片的數(shù)字化抗生素敏感性測試方法[11]。我們的設(shè)想是借助于數(shù)字化分析的精準(zhǔn)定量能力顯著縮短細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌懸液與抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴發(fā)生和捕獲,生成高密度微液滴陣列。通過對(duì)液滴陣列進(jìn)行熒光掃描成像,檢測每個(gè)液滴中的熒光信號(hào)并以此計(jì)算出細(xì)菌存活率(v)和陽性微液滴比例(p)。根據(jù)陽性微液滴比例,可以泊松分布算法推算出細(xì)菌密度,依據(jù)細(xì)菌密度變化可確定最小抑菌濃度(minimuminhibitory concentration,MIC)。我們的初步研究結(jié)果顯示應(yīng)用該方法僅需30 min抗生素暴露時(shí)間即可判定大腸桿菌的抗生素敏感性。

圖3A.液滴微流控芯片原理設(shè)計(jì)圖結(jié)構(gòu)包含上游的液滴生成區(qū)和下游的液滴捕獲區(qū);B.利用液滴熒光成像分辨細(xì)菌陽性和陰性液滴;C.液滴數(shù)字化分析顯示健康人和尿路感染病人尿液細(xì)菌計(jì)數(shù)差別;D.液滴數(shù)字化分析顯示敏感和耐藥細(xì)菌對(duì)于抗生素的反應(yīng)。

(四)細(xì)胞水平抗腫瘤藥物敏感性測試

體外抗腫瘤藥物敏感性測試是指導(dǎo)抗腫瘤藥物合理使用的有效手段。雖然基因檢測可以用來預(yù)測抗腫瘤藥物敏感性,然而該方法存在一定的不確定性。相比之下,細(xì)胞水平的藥物測試仍然是判定抗腫瘤藥物敏感性更為直接可靠的手段。然而,由于細(xì)胞水平抗腫瘤藥物敏感性測試存在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大、測試通量有限以及操作難于標(biāo)準(zhǔn)化等問題,至今在臨床難以推廣。

針對(duì)該問題,課題組開發(fā)了一套微流控腫瘤微陣列藥物測試系統(tǒng)[12],其核心是一種復(fù)合式結(jié)構(gòu)開放式微流控芯片。芯片頂層是開放式儲(chǔ)液池,底層是細(xì)胞培養(yǎng)池陣列,中間層是納米孔薄膜。利用納米孔薄膜不允許液體通過只允許跨膜擴(kuò)散的特性,將其用做止流閥實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸液自動(dòng)分配以及用作擴(kuò)散屏障仿真血管內(nèi)皮層。配合移液工作站,這種微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)藥物篩選所包含的長期細(xì)胞培養(yǎng)、換液、多藥物處理以及細(xì)胞存活檢測等一系列操作步驟。

研究利用自行設(shè)計(jì)加工的1010微流控細(xì)胞培養(yǎng)陣列芯片,實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)陣列構(gòu)建、長期細(xì)胞培養(yǎng)、換液、多藥物處理以及細(xì)胞存活檢測等一系列功能。乳腺癌細(xì)胞在持續(xù)培養(yǎng)3天后增殖形成了類組織結(jié)構(gòu)。利用開放式微流控組織陣列芯片實(shí)現(xiàn)了3因素3水平正交藥物組合測試,并依據(jù)細(xì)胞存活率檢測結(jié)果篩選出最佳的抗乳腺癌藥物組合。研究結(jié)果顯示這種明微流控芯片能夠以高度仿真的組織實(shí)現(xiàn)多藥組合測試,因而有潛力成為指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)治療的有力工具。

圖4A.微流控腫瘤微陣列藥物測試系統(tǒng)包含一種復(fù)合式結(jié)構(gòu)開放式微流控芯片以及移液工作站;B.微流控芯片上腫瘤微環(huán)境重建的示意圖。3D培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞模擬腫瘤實(shí)質(zhì),水凝膠模擬支持和滋養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的腫瘤基質(zhì),納米孔薄膜擴(kuò)散屏障模擬血管內(nèi)皮層;C.微流控芯片上連續(xù)三天內(nèi)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖情況。(Calcein-AM/EthD-1染色,比例尺:200μm);D.抗腫瘤藥物正交組合測試結(jié)果。藥物測試包括LO2肝細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)A.阿霉素,B.紫杉醇和C.順鉑的3因素3水平正交組合藥物的反應(yīng)。

通過上述應(yīng)用實(shí)例,我們將微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢概括為:1.應(yīng)用場景的拓展;2.分析效率的提高;3.分析時(shí)間的縮短以及4.檢測精度的提升。由此可見,微流控芯片是極具優(yōu)勢的體外診斷技術(shù)平臺(tái)。


四、微流控體外診斷技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

目前,我國正處于巨大的社會(huì)變革過程,一方面國力的增強(qiáng)和科技的進(jìn)步促進(jìn)了新技術(shù)的發(fā)展和推廣,另一方面新形勢對(duì)于體外診斷行業(yè)提出了新的要求。體外診斷作為一個(gè)高附加值行業(yè),將會(huì)在未來相當(dāng)長的階段中快速發(fā)展,甚至成為國家的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著醫(yī)療改革的推進(jìn),三級(jí)醫(yī)療體系將逐漸完善,隨之而來的是醫(yī)療資源由集中轉(zhuǎn)變變?yōu)榉稚⒛J健9⑨t(yī)院的改革以及第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的興起,勢必會(huì)對(duì)體外診斷技術(shù)提出更高的要求。在這種形勢下,微流控技術(shù)將會(huì)對(duì)體外診斷行業(yè)的發(fā)展提供一個(gè)有利的契機(jī)。

現(xiàn)實(shí)中的微流控技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)程仍然是步履艱難。從技術(shù)角度來看,微流控體外診斷產(chǎn)品開發(fā)涉及多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域,包括醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)和工程等。任何一個(gè)企業(yè),想要建立這樣一個(gè)規(guī)模的研發(fā)隊(duì)伍都絕非易事。作為微流控系統(tǒng)的核心,微流控芯片的設(shè)計(jì)、材料選擇、表面處理、芯片加工乃至包裝保存,都具有一定技術(shù)難度。因此,微流控產(chǎn)品的研發(fā)難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)體外診斷產(chǎn)品。從產(chǎn)業(yè)環(huán)境角度來看,研究、生產(chǎn)和應(yīng)用單位的脫節(jié),高端加工技術(shù)的欠缺都增加了微流控產(chǎn)品開發(fā)的難度。此外,近期實(shí)體經(jīng)濟(jì)的低迷也導(dǎo)至企業(yè)對(duì)于這種高技術(shù)含量產(chǎn)品研發(fā)信心不足。對(duì)于微流控體外診斷產(chǎn)品開發(fā),我們認(rèn)為以下幾個(gè)方面需要關(guān)注:首先是明確的市場定位,相比較傳統(tǒng)技術(shù),微流控產(chǎn)品必須在某個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域或應(yīng)用場景下具有突出的優(yōu)勢;其次是前期研究基礎(chǔ)。由于微流控產(chǎn)品研發(fā)技術(shù)門檻較高,缺少扎實(shí)的研究基礎(chǔ)會(huì)增加開發(fā)進(jìn)程的不確定性;再者就是盡量規(guī)避技術(shù)制約。由于各種條件限制,某些類型芯片可能在一定階段內(nèi)不具備量產(chǎn)可行性。因此,我們對(duì)于微流控診斷產(chǎn)品開發(fā)的建議是:1.選擇恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用對(duì)象;2.整合研發(fā)資源;3.開拓創(chuàng)造性的產(chǎn)學(xué)研合作模式。


五、結(jié)語

總體看來,微流控體外診斷技術(shù)的發(fā)展前途是光明的,道路是曲折的。無論如何,我們堅(jiān)信微流控技術(shù)是新形勢下應(yīng)對(duì)臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)的有力工具,該技術(shù)勢必會(huì)對(duì)臨床檢驗(yàn)?zāi)芰Φ奶嵘鸬骄薮蟮耐苿?dòng)作用。

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