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蛋白質(zhì)結(jié)晶方法大總結(jié)

來源:范文中心 瀏覽 2749 次 發(fā)布時(shí)間:2022-09-15

1.1結(jié)晶方法(CrystallizationTechniques)

1.1.1分批結(jié)晶(BatchCrystallization)這是最老的最簡(jiǎn)單的結(jié)晶方法,其原理是同步地在蛋白質(zhì)溶液中加入沉淀劑,立即使溶液達(dá)到一個(gè)高過飽和狀態(tài)。幸運(yùn)的話,不需進(jìn)一步處理即可在過飽和溶液中逐漸長(zhǎng)出晶體。一個(gè)用于微分批結(jié)晶的自動(dòng)化系統(tǒng)已被Chayen等人設(shè)計(jì)出(1991,1992),其微分批方法中,他們?cè)冢保拨蹋彀鞍踪|(zhì)和沉淀劑的液滴中生長(zhǎng)晶體。液滴被懸浮在油(如石蠟)中,油的作用是作為封層以防止蒸發(fā),它并不干擾普通沉淀劑,但是干擾能溶解油的有機(jī)溶劑(Chayen,1997;seealsoChayen,1998)。

1.1.2液-液擴(kuò)散(Liquid–LiquidDiffusion)這種方法中,蛋白質(zhì)溶液和含有沉淀劑的溶液是彼此分層在一個(gè)有小孔的毛細(xì)管中,一個(gè)測(cè)熔點(diǎn)用的毛細(xì)管一般即可(如圖1.2)。下層是密度大的溶液,例如濃硫酸銨或PEG溶液。如果有機(jī)溶劑如MPD被用作沉淀劑,它會(huì)在上層。以1:1混合,沉淀劑的濃度應(yīng)該是所期最終濃度的二倍。兩種溶液(各自約5μl)通過注射器針頭導(dǎo)入毛細(xì)管,先導(dǎo)入下層的。通過一個(gè)簡(jiǎn)易的搖擺式離心機(jī)去除氣泡。再加入上層,進(jìn)而兩層之間形成一個(gè)明顯的界面,它們會(huì)逐漸彼此擴(kuò)散。Garc′?a-RuizandMoreno(1994)已經(jīng)發(fā)展液-液擴(kuò)散技術(shù)至針刺法。蛋白質(zhì)溶液通過毛細(xì)力被吸入狹窄的管中,管的一端是封閉的。接著,開放端被插入置于小容器的凝膠中,凝膠使得管豎直,蛋白質(zhì)溶液與凝膠接觸。含有沉淀劑的溶液被倒在凝膠上,整個(gè)裝置被保存于封閉的盒子以防蒸發(fā)。沉淀劑通過凝膠和毛細(xì)管的擴(kuò)散時(shí)間可以由毛細(xì)管插入凝膠的深度控制,從而蛋白質(zhì)溶液中即可形成過飽和區(qū)域,毛細(xì)管底部高而頂部低。這也可作為一個(gè)篩選最佳結(jié)晶條件的額外信息。

1.1.3蒸氣擴(kuò)散(VaporDiffusion)

1.1.3.1懸滴法(TheHangingDropMethod)這種方法中,在一個(gè)硅化的顯微鏡蓋玻片上通過混合3-10μl蛋白質(zhì)溶液和等量的沉淀劑溶液來制備液滴。蓋玻片置于一個(gè)盤子的凹槽之上,凹槽的一部分填有所需的沉淀劑溶液約1ml。在蓋玻片放好之前,小室的凹槽周圍用油或油脂密封(如圖3)。

1.1.3.2沉滴法(TheSittingDropMethod)在懸滴法中,如果蛋白質(zhì)溶

液表面張力很小就會(huì)在蓋玻片表面展開。此時(shí),沉滴法更有利,圖4給出了沉滴法的簡(jiǎn)圖。

1.1.4透析法(Dialysis)除了上述使得蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法,還有許多透析技術(shù)。透析的優(yōu)點(diǎn)是沉淀溶液容易改變,對(duì)于適量的蛋白質(zhì)溶液(多于0.1ml),可用透析管完成(如圖1.5a)。透析膜通過橡皮圈連在管子上,但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮約10min。對(duì)微升量的蛋白質(zhì)溶液而言,可以使用覆有透析膜的厚壁微毛細(xì)管(Zeppezauermethod)或者樹脂玻璃紐扣(如圖1.5b)。紐扣的缺點(diǎn)是紐扣中的蛋白質(zhì)晶體不能通過極化顯微鏡觀察到。

另一中微透析方法在圖1.6中有描述,將5μl蛋白質(zhì)溶液注射到一個(gè)毛細(xì)管中,毛細(xì)管覆有透析膜,膜可用塑料管套緊。對(duì)蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行簡(jiǎn)單離心,然后用鑄模粘土將毛細(xì)管封閉,接著將毛細(xì)管放入含有透析液的Eppendorf管中。

機(jī)遇造就第一個(gè)膜蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析

1988年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予三位德國(guó)科學(xué)家,他們分別是哈特穆特·米歇爾(HartmutMichel)、約翰·戴森霍弗(JohannDeisenhofer)和羅伯特·休伯(RobertHuber),以表彰他們對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)的巨大貢獻(xiàn)。這三個(gè)人通力合作,在世界上首次解析了一種膜蛋白——紫細(xì)菌光合反應(yīng)中心的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。紫細(xì)菌光合反應(yīng)中心三維結(jié)構(gòu)的解析,拉開了膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)的序幕,在生物學(xué)界影響非常大。然而,在這樣一個(gè)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的重大研究成果背后,卻隱藏著一段不為人知的故事,其中就包涵了“抓住機(jī)遇發(fā)現(xiàn)科學(xué)事實(shí)”的科學(xué)方法論。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的最基本物質(zhì)之一,它在生物體的各種生命活動(dòng)中扮演著極其重要的角色,如催化體內(nèi)幾乎全部反應(yīng)的酶。在所有蛋白質(zhì)中,膜蛋白的作用更為重要。膜蛋白位于細(xì)胞的膜系統(tǒng)上,充當(dāng)很多角色,比如細(xì)胞膜上用來接受胞外信號(hào)的受體,以及用來轉(zhuǎn)運(yùn)離子和分子的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體。為了解釋蛋白質(zhì)的具體作用機(jī)制,就必須在原子分辨率水平觀察到蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),以及蛋白質(zhì)和與其相互作用的分子形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。這要用到一種叫做X射線晶體學(xué)的方法。據(jù)統(tǒng)計(jì),X射線晶體學(xué)已造就了十多個(gè)諾貝爾獎(jiǎng)。使用這種方法的前提是得到所研究對(duì)象的高質(zhì)量單晶,若要解析某個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),就首先要生長(zhǎng)出目標(biāo)蛋白的單晶。這對(duì)于一般的胞內(nèi)可溶性蛋白來說,似乎不是那么難。1962年,兩位英國(guó)科學(xué)家約翰·考德里·肯德魯(JohnCowderyKendrew)和馬科斯·斐迪南·佩魯茲(MaxFerdinandPerutz)因?qū)〖t蛋白結(jié)構(gòu)的研究而被授予當(dāng)年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這里說到的肌紅蛋白是一種胞內(nèi)可溶性蛋白,而不是膜蛋白??扇苄缘鞍椎慕Y(jié)晶雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn),但是這對(duì)膜蛋白來說還不能實(shí)現(xiàn)。由于膜蛋白具有很強(qiáng)的疏水性,在溶液中是難溶的,因此想要得到膜蛋白的晶體在當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是不可能的,這一點(diǎn)已經(jīng)寫進(jìn)了當(dāng)時(shí)的權(quán)威教科書。

首次成功得到膜蛋白的晶體源于哈特穆特·米歇爾的一次偶然發(fā)現(xiàn)。米歇爾于1948年出生在德國(guó)符騰堡州的路德維希堡。大學(xué)畢業(yè)后,他在圖賓根馬普研究所的迪特爾·奧斯蒂希特(DieterOesterhelt)實(shí)驗(yàn)室做關(guān)于鹽桿菌的研究。當(dāng)時(shí),奧斯蒂希特與他人合作在鹽桿菌中發(fā)現(xiàn)了菌紫紅質(zhì),后來他提出菌紫紅質(zhì)可看作皮特·米切爾(PeterMitchell,1978年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者)的化學(xué)滲透理論框架中的光驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泵。米歇爾于1977年在維爾茨堡馬普研究所取得博士學(xué)位后,作為課題的延續(xù),他打算將脫脂的菌紫紅質(zhì)與細(xì)菌囊泡進(jìn)行融合,以實(shí)現(xiàn)光驅(qū)動(dòng)的氨基酸攝入。當(dāng)樣品在冰箱里貯存期間,米歇爾偶然發(fā)現(xiàn)脫脂的菌紫紅質(zhì)形成了固態(tài)的玻璃狀聚集體?;谶@個(gè)發(fā)現(xiàn),他確信應(yīng)該可以生長(zhǎng)出像菌紫紅質(zhì)這樣的膜蛋白的晶體,雖然這在當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是不可能的。米歇爾關(guān)于結(jié)晶菌紫紅質(zhì)的想法得到了他的導(dǎo)師奧斯蒂希特的鼓勵(lì)和支持,于是實(shí)驗(yàn)正式啟動(dòng)。四周后,米歇爾就得到了菌紫紅質(zhì)的二維晶體,但不是他所想要的用來做X射線衍射實(shí)驗(yàn)的三維晶體。功夫不負(fù)有心人,終于在1979年4月,米歇爾得到了第一個(gè)真正的菌紫紅質(zhì)三維晶體。于是,他取消了去美國(guó)攻讀博士后的計(jì)劃,把全部精力投在了繼續(xù)生長(zhǎng)菌紫紅質(zhì)晶體上。

雖然得到了菌紫紅質(zhì)的三維晶體,但是當(dāng)米歇爾進(jìn)行X射線衍射實(shí)驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)該晶體內(nèi)部堆積混亂,而且晶體又小,不足以進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。此外,由于當(dāng)時(shí)德國(guó)沒有X射線衍射儀,他只能去英國(guó)劍橋去試晶體。在劍橋,很多晶體學(xué)家則要做關(guān)于可溶性蛋白晶體的X射線衍射實(shí)驗(yàn),所以即使米歇爾去了英國(guó),也幾乎沒有機(jī)會(huì)能用上X射線衍射儀。然而,他沒有浪費(fèi)時(shí)間,而是在這段時(shí)間對(duì)菌紫紅質(zhì)的晶體進(jìn)行了優(yōu)化。后來,米歇爾回到德國(guó),他所在實(shí)驗(yàn)室的主任羅伯特·休伯決定購(gòu)買一臺(tái)X射線衍射儀以滿足米歇爾的實(shí)驗(yàn)需要,可惜的是菌紫紅質(zhì)的晶體質(zhì)量一直沒能提高。

盡管遭受重大挫折,但是米歇爾根據(jù)他最初的觀察和分析,堅(jiān)信自己一定能長(zhǎng)出高質(zhì)量的膜蛋白單晶。于是,他嘗試去結(jié)晶別的膜蛋白,其中最有希望的膜蛋白——紫細(xì)菌光合反應(yīng)中心被成功結(jié)晶了,而且衍射質(zhì)量非常好,這是在1981年9月。在X射線衍射儀上收集了大量數(shù)據(jù)后,米歇爾就開始了結(jié)構(gòu)分析工作。后來,約翰·戴森霍弗也加入到了這個(gè)課題研究中來。最終,他們成功解析了紫細(xì)菌光合反應(yīng)中心的三維結(jié)構(gòu),分辨率為3埃,文章發(fā)表于1985年Nature雜志上。僅僅三年后,米歇爾、戴森霍弗和休伯就被授予1988年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),這不能不說是一個(gè)奇跡,因?yàn)楂@得諾貝爾獎(jiǎng)的成果大多是要經(jīng)過十年以上的等待后才被授予諾貝爾獎(jiǎng)的。

米歇爾獲諾貝爾獎(jiǎng)時(shí)只有40歲,這在諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者中是相當(dāng)年輕的。米歇爾不僅是解析第一個(gè)膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的最大貢獻(xiàn)者,還是后來膜蛋白結(jié)晶技術(shù)發(fā)展過程中抗體片段介導(dǎo)的膜蛋白結(jié)晶法的發(fā)明者。由米歇爾等三位諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者開啟的膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)現(xiàn)在已經(jīng)非常熱門。2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)再一次被授予解析細(xì)胞膜上的鉀離子通道和水通道的兩位美國(guó)科學(xué)家——羅德里克·麥金農(nóng)(RoderickMackinnon)和皮特·阿格雷(PeterAgre)?;仡櫭仔獱柍晒Y(jié)晶第一個(gè)膜蛋白的歷程,1977年的那次偶然發(fā)現(xiàn)是至關(guān)重要的。如果當(dāng)時(shí)他沒有仔細(xì)觀察,或者觀察到了卻沒當(dāng)作一回事,那么他也就不會(huì)去嘗試結(jié)晶膜蛋白了,更不會(huì)獲得諾貝爾獎(jiǎng)了。正是由于他抓住了那次機(jī)遇,進(jìn)行了認(rèn)真分析后,堅(jiān)信自己一定能生長(zhǎng)出當(dāng)時(shí)被認(rèn)為不可能的膜蛋白晶體。于是,他那樣做了,他打破常規(guī)的創(chuàng)新想法受到了導(dǎo)師的大力支持,最終他成功了!

像這樣的例子還有很多,比如日本科學(xué)家白川英樹發(fā)現(xiàn)導(dǎo)電塑料,華裔科學(xué)家錢永健發(fā)明鈣染料等。無數(shù)科學(xué)研究上的成功案例告訴我們:一定要抓住機(jī)遇發(fā)現(xiàn)科學(xué)事實(shí)!同時(shí),必須記?。簷C(jī)遇只偏愛有準(zhǔn)備的頭腦。在科研過程中,我們應(yīng)該隨時(shí)準(zhǔn)備著去發(fā)現(xiàn),去思考,去探索!

諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)之核糖體的精細(xì)復(fù)雜的晶體結(jié)構(gòu)

真的沒有想到今年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)會(huì)頒給核糖體的結(jié)構(gòu)研究,不過還是非常興奮的,因?yàn)楸救艘嘣趶氖峦ㄟ^X射線晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的研究。曾經(jīng)就覺得解析核糖體(由大、小兩個(gè)亞基構(gòu)成)的晶體結(jié)構(gòu)的文章很不平凡,因?yàn)閳?bào)道大亞基結(jié)構(gòu)的文章在Science上撰寫了16頁(yè)(普通文章4頁(yè)左右);剛查到報(bào)道小亞基結(jié)構(gòu)的文章亦在Nature上撰寫了13頁(yè)(普通文章6頁(yè)左右)。

這兩篇文章以及另一篇解析核糖體小亞基的文章都發(fā)表于2000年,也就是說短短過了9年,三位負(fù)責(zé)人就獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。當(dāng)然這里說短短其實(shí)已經(jīng)非常長(zhǎng)了(原因下一篇再談,呵呵)。

接下來,就來看看他們?nèi)坏慕^世文章及里面的精美圖片吧!

蛋白質(zhì)結(jié)晶系列之一(自譯)

1.蛋白質(zhì)結(jié)晶(CrystallizingaProtein)

1.1引言(Introduction)

當(dāng)別人在談?wù)摳盗⑷~和帕特森,或者分子置換及分子動(dòng)力學(xué)改良時(shí),新到蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)們可能會(huì)迷惑。然而,他們立即會(huì)明白要想確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),首先必須生長(zhǎng)出合適的晶體。沒有晶體,便談不上用X射線確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。這一章,我們討論蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的原理。作為實(shí)踐,我們將給出結(jié)晶溶菌酶的方法。我們還將得到一個(gè)溶菌酶晶體的X射線衍射圖像,

這將提供對(duì)X射線衍射的簡(jiǎn)介。這一章包括一個(gè)關(guān)于常見問題的討論。

1.2蛋白質(zhì)結(jié)晶原理(PrinciplesofProteinCrystallization)

蛋白質(zhì)的X射線結(jié)構(gòu)分析首先要獲得合適的單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)尚未發(fā)展成熟,盡管很受人親睞,特別是受航天飛機(jī)中微重力實(shí)驗(yàn)(Kundrotetal.,2001;McPhersonetal.,1995)的激發(fā)。蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個(gè)反復(fù)試驗(yàn)的過程,蛋白質(zhì)逐漸會(huì)從溶液中析出,雜質(zhì)、晶核及其他未知因素對(duì)此過程有所影響。通常,蛋白質(zhì)越純,生長(zhǎng)晶體幾率越大。蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)者對(duì)蛋白質(zhì)的純度要求要嚴(yán)于生化學(xué)家的要求,后者往往在酶催化活性足夠高時(shí)就很滿意。另一方面,為了使蛋白質(zhì)結(jié)晶,不僅要加其他成分,所有蛋白質(zhì)分子的表面性質(zhì)也必須是相同的,特別是表面的電荷分布,因?yàn)樗绊懢w內(nèi)分子的聚集。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)結(jié)晶中的一種有效工具,例如檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)、樣品純度、重原子衍生物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性(Cohen,1996;Potieretal.,2000)。

蛋白質(zhì)結(jié)晶涉及四個(gè)重要步驟如下:

1.蛋白質(zhì)純度的確定。如果不夠非常純,必須要進(jìn)一步純化。

2.蛋白質(zhì)溶解于合適的溶劑中,從中它能通過一種鹽或有機(jī)化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液,有時(shí)加有機(jī)溶劑,如2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)。正常情況下,沉淀劑也被加入,但是濃度不高于使沉淀產(chǎn)生。對(duì)于不溶于水-緩沖劑或水-有機(jī)溶劑的膜蛋白,還需要加入去污劑。

3.使溶液過飽和。在這一步中,小聚集體形成,它是晶體生長(zhǎng)所需的核。對(duì)小分子的結(jié)晶來說,相比于蛋白質(zhì)更為人熟知,晶核的自發(fā)形成需要提供表面張力能。一旦這個(gè)能障被突破了,晶體開始生長(zhǎng)。能障在高水平的過飽和度時(shí)很容易克服。因此,在高過飽和度時(shí),晶核更易自發(fā)形成。晶核的形成可作為一個(gè)過飽和度和其他參數(shù)的函數(shù)通過多種方法來研究,包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。

4.一旦晶核形成,晶體生長(zhǎng)正式開始。對(duì)低分子量的化合物而言,新分子會(huì)逐步結(jié)合到正在生長(zhǎng)的晶體表面。這是由于這些位置的結(jié)合能比較大,相對(duì)于分子結(jié)合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成,要么發(fā)生在表面隨機(jī)形成的晶核。

蛋白質(zhì)結(jié)晶系列之二(自譯)

理論告訴我們,最好的晶體生長(zhǎng)要減少過飽和度到一個(gè)低的水平;維持高飽和度可能導(dǎo)致過多晶核的形成,從而產(chǎn)生很多小晶體(如圖1.1)。同時(shí),晶體需要緩慢地生長(zhǎng)以在表面達(dá)到一個(gè)最高的有序度。然而實(shí)際中,并沒有遵從這個(gè)基本規(guī)則。最簡(jiǎn)單的改變過飽和度的方式是改變溫度或沉淀劑的濃度。

蛋白質(zhì)沉淀可以通過添加鹽、聚乙二醇或有機(jī)溶劑。作為沉淀劑,鹽有雙重作用,即鹽析和鹽溶。鹽離子屏蔽了蛋白質(zhì)分子表面的電荷,因此從而減弱了分子間的排斥力。此外,部分水被固定從而不可與蛋白質(zhì)結(jié)合,因?yàn)辂}離子周圍形成水化層。最常用的鹽是硫酸銨,其優(yōu)點(diǎn)是溶解性好,對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)無損害,即使?jié)舛群芨摺?

聚乙二醇對(duì)水有高親和性,能像鹽那樣固定水。而且,它以不同的方式影響蛋白質(zhì)的溶解度。PEG分子不能超過其半徑而更接近蛋白質(zhì)分子表面,蛋白質(zhì)分子周圍有PEG中心不能接近的水化層。如果蛋白質(zhì)分子聚集,這些水化層

部分重疊,從而不可接近的區(qū)域變小。結(jié)果,可接近區(qū)域變大。從而有更多的空間對(duì)PEG分子可用,它們的熵增加(以一些蛋白質(zhì)熵為代價(jià)),系統(tǒng)的自由能降低。因此,蛋白質(zhì)分子聚集的這種情況在使用PEG時(shí)是最有利的。

蛋白質(zhì)結(jié)晶中最普遍的有機(jī)溶劑是MPD。有機(jī)溶劑具有靜電效應(yīng),它們能降低介質(zhì)的的介電常數(shù)。靜電力變強(qiáng),從而壓縮蛋白質(zhì)分子周圍離子的雙電層。這些分子可以彼此更加接近,如果在一個(gè)有利的方向,它們便可以聚集。

一些蛋白質(zhì)在水中溶解度不好,但是如果加入少量鹽(比鹽析少的多)就可溶解。移除鹽后,蛋白質(zhì)便會(huì)析出。這種鹽溶效應(yīng)可以解釋為蛋白質(zhì)分子表面帶電基團(tuán)和溶液中離子相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果。在有溶劑離子時(shí),蛋白質(zhì)分子不會(huì)被離子雙層包圍,而能通過不同蛋白質(zhì)分子上異種電荷之間的庫(kù)侖力相互聚集。如果少量離子被加入,蛋白質(zhì)周圍會(huì)形成離子雙層,它們彼此之間不擴(kuò)散不排斥。

其他降低蛋白質(zhì)溶解度的方法有改變?nèi)芤海穑然驕囟取?

綜上所述,通常結(jié)晶蛋白質(zhì)的步驟如下:

1.仔細(xì)檢測(cè)純度。

2.a.慢慢增加沉淀劑的濃度,如PEG、鹽或有機(jī)溶劑等。

b.改變pH或溫度。

實(shí)際中,通??捎米鹘Y(jié)晶實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)的量非常少。要確定最好的結(jié)晶條件,經(jīng)常需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)。因此,每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該用最少量的蛋白質(zhì)。一個(gè)合理大?。ǎ埃病粒埃病粒埃玻恚恚剑埃埃埃福恚恚常┑牡鞍踪|(zhì)晶體重約10μg。因此,1mg純化的蛋白質(zhì)可以足夠做大約100次結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。

膜蛋白在水中不溶解,因此很難結(jié)晶。通常的策略是使用洗滌劑將其溶解于水溶液中,然后采用水溶性蛋白的操作程序(Michel,1990;Sowadski,1994)。Landau和Rosenbusch(1996)引進(jìn)一種新的方法能夠結(jié)晶膜蛋白。他們采用脂立方相作為各種化合物結(jié)晶的母體,脂立方相是具有立體對(duì)稱性的液晶,它們能在脂和水的混合物中形成(LindblomandRilfors,1989)。一些類型的脂立方相是存在的。Landau等人(1997)成功地在某一類型脂立方相中生長(zhǎng)出了高度有序的細(xì)菌視紫紅質(zhì)(bacteriorhodopsin)膜蛋白晶體(seealsoGouaux,1998)。但仍要看是否這種方法在結(jié)晶更多膜蛋白中取得成功。

科研中沒有不可能的事!請(qǐng)看這里

1979年以前幾乎沒有人認(rèn)為膜蛋白可以得到晶體,用于X射線衍射分析;德國(guó)科學(xué)家哈特姆特·米歇爾不信,他從79年開始著手膜蛋白的結(jié)晶。結(jié)果,于1985年成功解析世界上第一個(gè)膜蛋白-紫細(xì)菌光合反應(yīng)中心!于1988年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

離子通道被人們證實(shí)了多年,但一直未能得到其晶體結(jié)構(gòu)。1998年,美國(guó)科學(xué)家麥克金龍等成功得到了鉀通道的晶體結(jié)構(gòu),從而開辟了離子通道研究的新時(shí)代!于2003年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

多年來人們一直認(rèn)為β腎上腺素受體的晶體結(jié)構(gòu)是不可能得到的,結(jié)果就在去年,美國(guó)科學(xué)家終于得到了!β腎上腺素受體屬于G蛋白偶聯(lián)的受體。當(dāng)今,有50%以上的藥物的靶點(diǎn)都在G蛋白偶聯(lián)的受體,可見其重要性。在人體內(nèi),G蛋白偶聯(lián)受體是多種激素、神經(jīng)遞質(zhì)等發(fā)揮作用所必不可少的!至今獲得高分辨率解析的只有視紫紅質(zhì)和β1和β2腎上腺素受體,然而,G蛋白偶聯(lián)受體家族有五大類共800多種蛋白,看來要搞清楚這些還有很長(zhǎng)一段路要走。同是在2007年,12月的一期Nature雜志上刊登了一位科學(xué)家的三篇文章,分別是關(guān)于Na+,K+-ATPase、H+-ATPase和

Ca2+-ATPase的晶體結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制解析,這三者是在離子跨膜主動(dòng)運(yùn)輸中發(fā)揮著“泵”的作用的三種重要的跨膜蛋白。

什么叫不可能?沒有什么不可能!大家務(wù)必記住這一點(diǎn)!

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