摘要

開發(fā)對宿主細(xì)胞具有良好生物相容性但對癌細(xì)胞具有高效力的功能性生物材料和藥物是一項具有挑戰(zhàn)性的工作。通過利用天然抗菌肽和a-螺旋蛋白的優(yōu)勢特性，我們設(shè)計了一類新的短a-螺旋肽G（IIKK）nI-NH2（n細(xì)胞）。我們表明，含有?n1e4的肽具有不同的效力和對癌癥?3和4的高選擇性，能夠有效殺死癌細(xì)胞，同時在其工作濃度下對宿主細(xì)胞保持良性，通過類似于殺菌效果的機械過程。細(xì)胞的高選擇性可能源于它們優(yōu)先與帶有負(fù)電荷和高流動性的細(xì)胞外膜結(jié)合。除了快速透膜能力外，這些肽還可以通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，而不會誘導(dǎo)非特異性免疫原性反應(yīng)。重要的是，這些肽還可以在小鼠異種移植模型中抑制腫瘤生長，而不會引起副作用。雖然這項研究揭示了這些肽作為強效藥物和其他醫(yī)療保健應(yīng)用的臨床潛力，但它也指出了基礎(chǔ)材料研究在高選擇性肽功能材料未來發(fā)展中的重要性。

1.導(dǎo)言

尋找高效低毒副作用的新藥已成為功能性生物材料研究的重要方向。盡管治療方法取得了巨大進(jìn)步，但癌癥仍然是全世界致死的主要原因。化療是目前治療的主要策略之一，尤其是對于那些處于晚期或轉(zhuǎn)移階段的患者[1]。然而，對正常細(xì)胞和組織的嚴(yán)重副作用以及癌細(xì)胞容易獲得多藥耐藥性往往與常規(guī)化療藥物密切相關(guān)。因此，開發(fā)對正常宿主細(xì)胞具有低毒性的新型抗癌藥物和不利于耐藥性的獨特作用模式代表了開發(fā)更有效抗癌材料的新方向。這一領(lǐng)域的進(jìn)展可能會在醫(yī)療保健和治療策略方面開辟新的應(yīng)用領(lǐng)域。

一段時間以來，天然抗菌肽（AMPs）及其合成類似物一直被視為新抗生素的潛在來源。AMP對廣泛的微生物表現(xiàn)出不同的抗菌活性，有趣的是，其中一些還表現(xiàn)出對癌細(xì)胞的毒性，但對正常哺乳動物細(xì)胞的生物相容性程度不同[2e4]。此外，由于這些AMP主要通過非受體介導(dǎo)的途徑作用于靶細(xì)胞膜，與傳統(tǒng)化療藥物相比，癌細(xì)胞更難產(chǎn)生耐藥性[3,4]。由于這些理想的特性，研究和開發(fā)具有癌細(xì)胞毒性的AMPs可能會在開發(fā)更好的抗癌藥物方面取得進(jìn)一步進(jìn)展。短的線性陽離子AMP在與其靶相互作用時折疊成兩親構(gòu)象，代表了抗菌肽的一種特別成功的結(jié)構(gòu)安排[5e7]。為了提高其在治療應(yīng)用中的前景，并研究結(jié)構(gòu)活性關(guān)系，已經(jīng)設(shè)計和合成了許多類似物，以模擬天然AMPs的特征，并有不同的成功報道。主要障礙在于調(diào)整針對宿主細(xì)胞的毒性的效力。

為了模擬AMPs和含有簡單a-螺旋重復(fù)序列的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特征，我們最近開發(fā)了一類含有簡單序列重復(fù)序列的短陽離子肽，G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）[8]。IIKK模塊在與兩親膜接觸時促進(jìn)a-螺旋結(jié)構(gòu)，并且隨著n的增加，其結(jié)構(gòu)傾向性提高。C端的額外I殘基穩(wěn)定了分子，進(jìn)一步促進(jìn)了二級結(jié)構(gòu)的反應(yīng)性；COO的C端電荷阻斷在觸發(fā)初始響應(yīng)和隨后的選擇性調(diào)節(jié)以響應(yīng)不同的外膜表面時非常敏感。因此，它們對抗天然AMP和療法的性能需要實驗驗證。

我們發(fā)現(xiàn)這些短合成肽具有很強的抗癌活性。為了探索其實際相關(guān)性，我們利用成人皮膚真皮成纖維細(xì)胞（HDFa）進(jìn)行了選擇性評估，采用了我們之前使用NIH 3T3細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞開發(fā)的培養(yǎng)實驗方法[8]。雖然我們在這里的主要目的是研究與所設(shè)計的肽的細(xì)胞選擇性和抗癌活性相關(guān)的機械過程，但本研究也檢查了它們對人類淋巴細(xì)胞的免疫原性反應(yīng)及其對裸鼠異種移植瘤的治療效果。

2.材料和方法

2.1.化學(xué)試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

Rink amide MBHA樹脂、受保護(hù)氨基酸以及用于肽合成的其他試劑和溶劑從德國勞埃德生化有限公司（中國上海）購買。3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化銨（MTT）、鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（鈣黃綠素AM）、4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和異硫氰酸熒光素（FITC）-甲環(huán)素從西格瑪（密蘇里州圣路易斯）獲得。5,50,6,60-四氯-1,10,3,30-四乙基苯并咪唑碳菁碘（JC-1）、抗Cyt c單抗體（小鼠，IgG2b）和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二級抗體購自Beyotime Biotechnology（江蘇，中國）。所有實驗中使用的水都是經(jīng)過密理博密理Q去離子處理的（18.2μcm）。

HeLa（人宮頸癌細(xì)胞）和HL60（人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞）由上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供。成人真皮成纖維細(xì)胞（HDFa）是從體外獲得的。癌細(xì)胞系在含有10%熱滅活FBS（胎牛血清）的IMDM（Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基）中培養(yǎng)，而原代HDFa細(xì)胞在補充了LSGS（低血清生長補充劑）和抗生素（阿莫西林和青霉素）的M106培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。

用標(biāo)準(zhǔn)的菲科爾法從全血細(xì)胞中分離人淋巴細(xì)胞。簡而言之，用10毫升PBS稀釋從健康志愿者獲得的10毫升血液，然后將稀釋后的血液小心地添加到1.077克/毫升的Ficoll溶液中，F(xiàn)icoll與血液的比例為2:1。在2000 rpm下離心15分鐘后，在不接觸Ficoll溶液的情況下收集含有淋巴細(xì)胞的環(huán)。淋巴細(xì)胞用PBS洗滌至少三次，然后懸浮在PBS中使用。

通過1000 g離心從血液中分離人類紅細(xì)胞（h-RBC），用PBS洗滌三次，然后在PBS中懸浮至8%（v/v）以供使用。

2.2.肽合成

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是使用商用CEM Liberty肽合成器，使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相肽合成程序制備的。在Rink酰胺MBHA樹脂上從C端到N端進(jìn)行合成，從而產(chǎn)生C端酰胺化肽。更多細(xì)節(jié)，包括樹脂的脫保護(hù)、偶聯(lián)和切割，已在前面描述[9e11]。請注意，N端FITC標(biāo)記的G（IIKK）3I-NH2也是通過固相化學(xué)合成的，我們之前的工作[8]中報告了詳細(xì)的步驟。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，通過冷乙醚沉淀至少八次純化粗肽產(chǎn)品，然后冷凍干燥2天。HPLC和MS分析表明，最終產(chǎn)物純度高（>95%）。

2.3.細(xì)胞毒性試驗

MTT法檢測這些肽的體外細(xì)胞毒性。簡單地說，癌癥或HDFa細(xì)胞（w1105細(xì)胞/mL，100 mL）在96孔板中預(yù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后，用100毫升2倍稀釋肽溶液（0e50 mM）處理細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)24小時。然后向每個孔中加入20毫升MTT溶液（PBS中，5 mg/mL）并培養(yǎng)4小時。隨后，直接去除HeLa或HDFa細(xì)胞的上清液，而對于HL60細(xì)胞，以1000 rpm的轉(zhuǎn)速離心培養(yǎng)物5分鐘，然后去除上清液。向每個孔中加入150 mL二甲基亞砜（DMSO），將孔的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并使用微孔板讀取器（M2 e，分子裝置）記錄570 nm處的吸光度。不含肽的孔用于對照，不含細(xì)胞的孔用于分光光度計的空白。實驗至少獨立進(jìn)行了三次。

通過檢測不同肽存在時h-RBC的血紅蛋白釋放來測定肽的溶血活性。將來自健康志愿者的h-RBC洗滌三次，并以8%（v/v）懸浮在PBS中。將100毫升2折疊肽溶液添加到96孔無菌板中的孔中。然后將等分（100 mL）的h-RBC懸浮液添加到孔中，以獲得200 mL的總體積。在37℃下將培養(yǎng)皿培養(yǎng)1 h，然后在1000 g下離心5 min。將等分（100 mL）的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔培養(yǎng)皿中，通過測量540nm處的吸光度來監(jiān)測血紅蛋白的釋放。以PBS和0.1%Triton X-100中的血紅蛋白釋放值作為陰性和陽性對照。

2.4.G（IIKK）3I-NH2的細(xì)胞選擇性

為了在體外評估G（IIKK）3I-NH2的選擇性相互作用，將FITC-G（IIKK）3I-NH2加入含有原代細(xì)胞（HDFa）和腫瘤細(xì)胞（HL60）的共培養(yǎng)系統(tǒng)（8孔板），最終肽濃度為20 mM。在37C和5%CO2孵育1小時并采用適當(dāng)?shù)姆蛛x程序（詳細(xì)程序見參考文獻(xiàn)8）后，用徠卡DMI3000熒光顯微鏡觀察兩種細(xì)胞中的肽分布。

2.5.肽對不同脂質(zhì)單分子膜的滲透

在多孔板Kibron微槽X（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）中跟蹤肽滲透到不同的脂質(zhì)單層。表面壓力（p）通過使用連接到Delta-Pi微天平（芬蘭赫爾辛基Kibron公司）的Wilhelmy板進(jìn)行監(jiān)測。氯仿中的脂質(zhì)溶液在空氣緩沖界面（10 mM TriseHCl，154 mM NaCl，pH 7.4）擴散。在不同初始表面壓力（pi，范圍為10至40 mN/m）下進(jìn)行溶劑蒸發(fā)和單層平衡后，將肽溶液注入單層下方，亞相中的最終肽濃度為3 mM。然后監(jiān)測表面壓力隨時間的變化，并在30分鐘內(nèi)獲得平衡表面壓力（pt）。為了比較G（IIKK）3I-NH2穿透飽和（DPPC）和不飽和（POPC）磷脂單分子膜的能力，初始表面壓力保持在30 mN/m左右。所有測量均在201C下進(jìn)行。

2.6.G（IIKK）3I-NH2在HeLa細(xì)胞中的定位

將HeLa細(xì)胞（w1105細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在6孔板中24小時，然后將FITC-G（IIKK）3I-NH2以10 mM的最終濃度添加到孔中。在37℃下培養(yǎng)1小時或24小時后，用PBS清洗細(xì)胞至少三次。用激光共聚焦顯微鏡（Nikon AI si）觀察FITC-G（IIKK）3I-NH2在HeLa細(xì)胞中的分布。

2.7.膜完整性

HeLa細(xì)胞（w1105個細(xì)胞/mL）在37C下預(yù)先接種在無菌96孔板上24小時。細(xì)胞用PBS清洗，并在37C下用鈣黃綠素AM（1 mM）染色30分鐘。用PBS清洗三次后，向每個孔中加入100 mL PBS，并通過微孔板自動讀數(shù)器記錄熒光（在490 nm處激發(fā)，在515 nm處發(fā)射），所得值作為對照。隨后，在37C下用最終肽濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2處理這些細(xì)胞不同時間（10 min 6 h）。在肽處理后，用PBS清洗細(xì)胞三次，并再次記錄細(xì)胞在100 mL PBS存在下的熒光。用PBS和1%Triton X-100處理的細(xì)胞分別作為陰性和陽性對照。

為了檢查細(xì)胞形態(tài)變化，將HeLa細(xì)胞（w1105個細(xì)胞/mL）在無菌6孔板底部的蓋玻片上預(yù)接種37C 24小時。預(yù)接種的細(xì)胞在37C下用濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2處理24小時，然后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS廣泛洗滌固定的細(xì)胞，并用不同濃度的乙醇脫水。在臨界點干燥和用濺射鍍金機鍍金后，使用JSM-840掃描電子顯微鏡在15 kV下觀察樣品。

2.8.F-肌動蛋白、細(xì)胞核、線粒體膜電位和細(xì)胞色素c的熒光染色

對于熒光染色，將HeLa細(xì)胞（w1105個細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在6孔板中24小時，然后向孔中添加最終濃度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2。在37℃下培養(yǎng)24小時后，用PBS清洗細(xì)胞，并用4%多聚甲醛固定15分鐘。用PBS清洗固定的細(xì)胞，并在37℃下用FITC phalloidin（5 mg/mL）對其進(jìn)行F-肌動蛋白染色或用DAPI（6 mg/mL）對其進(jìn)行核染色30分鐘。用PBS清洗后去除未結(jié)合的染料，熒光顯微鏡下觀察染色細(xì)胞。

為了跟蹤線粒體電位的變化，肽處理的HeLa細(xì)胞（本例中不使用4%多聚甲醛固定）在37C下用JC-1（10 mg/mL）染色20分鐘。然后用PBS洗滌染色的細(xì)胞，并用熒光顯微鏡觀察。

用抗細(xì)胞色素c單抗（mAb，小鼠IgG2b）對細(xì)胞色素c（Cyt-c）進(jìn)行免疫熒光染色，觀察細(xì)胞色素c（Cyt-c）在HeLa細(xì)胞中的分布。簡單地說，在用4%多聚甲醛固定后，用0.1%Triton X-100使肽處理的HeLa細(xì)胞通透性5分鐘，然后用封閉緩沖液（PBS中10%（v/v）胎牛血清）封閉30分鐘。在用PBS洗滌后，這些細(xì)胞在37℃下與抗Cyt c單克隆抗體（1:50）孵育1小時，并用PBS洗滌5分鐘以去除未結(jié)合的抗體，然后與FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二級抗體（1:100）孵育1小時。在用PBS廣泛洗滌以去除未結(jié)合的二級抗體后，用激光共聚焦顯微鏡觀察這些細(xì)胞。在上述所有熒光染色實驗中，未經(jīng)肽處理的細(xì)胞被用作對照。

2.9.DNA片段的凝膠電泳

將HeLa細(xì)胞（w1106個細(xì)胞/mL）預(yù)先接種在無菌6孔培養(yǎng)皿中24小時。在37C下與10 mM G（IIKK）3I-NH2培養(yǎng)不同時間間隔（48、24、12和6小時）后，收集HeLa細(xì)胞，并在37℃下用裂解緩沖液（0.8%十二烷基硫酸鈉、100 mM三氯化鈉、20 mM EDTA、0.15 mg/mL核糖核酸酶a、pH8.0）裂解2小時。裂解后，裂解物在50℃下與20 mL蛋白酶K（20 mg/mL）再孵育24小時，然后在含有0.5 mg/mL溴化乙錠（EB）的2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

2.10.RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和實時聚合酶鏈反應(yīng)）

為了確定HeLa細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞免疫效應(yīng)的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)行了RT-PCR檢測。簡單地說，HeLa細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育不同的時間間隔（1、3、6和12 h），淋巴細(xì)胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育1 h。按照制造商的說明（英國因維特羅根）用Trizol提取細(xì)胞總RNA?？俁NA（1mg）通過隨機引物（PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶，日本Takara）進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用power SYBR green PCR Master Mix kit（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）和7500實時PCR系統(tǒng)（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行實時PCR，并通過2 DDCt方法的相對定量分析數(shù)據(jù)。相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平被標(biāo)準(zhǔn)化為管家基因b-肌動蛋白的值。使用以下引物：b-肌動蛋白義：50-ATGCAGGGTACATGTGGT-30，反義：50-TCGTGCGTGACATTAAGAG-30；aspase-8義：50-ATGGACTTCAGCA-GAAATCTT-30，反義：50-CATGTCATCCAGTTGC-30；fas-sense:50-attatccaaagtgtta-30，反義：50-tcacaatcatctt-CTG-30；fas-L義：50-ATGCAGCCTTCAATT AC-30，反義：50-CAATCTACAGCAAGGCAC-30；IL2義：50-CaCaAttaacctCactCC TGCCAC-30，反義：50-cGTTGATTCTGATTAGCTGTAGTCATCTG-30；IL8順義：50-CGGAAGAACCATCCATCGTGTGG-30，反義：50-AGAATCAGAGAAG GCTGCCAAG-30。

2.11.對人宮頸癌異種移植瘤生長的抑制作用

肽，包括G（IIKK）3I-NH2和G（IIKK）4I-NH2，分別表示為3#和4#，在無菌PBS中溶解，濃度分別為0.15 mg/mL和0.5 mg/mL。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均體積100 mm3時，將PBS中的100 mL人宮頸癌HeLa細(xì)胞（2106個細(xì)胞/mL）皮下接種到5至6周齡裸鼠（BALB/c-null）的腋窩中（接種后5天），將小鼠隨機分為五組（每組5只）。通過腹腔注射將200e250 mL制備好的肽溶液注射到小鼠體內(nèi)，最終劑量為1.5 mg/kg或5 mg/kg，并將200e250 mL PBS注射作為陰性對照。請注意，我們將這一天定義為第0天。注射每隔一天進(jìn)行九次。在治療期間，每兩天測量一次小鼠的腫瘤大小和體重。在第18天，處死小鼠，移除腫瘤，拍照并稱重。