1.3.3.5活性巰基含量

參照Ellman和Guo Xiaoya等的方法并加以修改。利用磷酸鹽緩沖液將3種肌漿蛋白的質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋到1 mg/mL，取5 mL置于離心管中，加入20μL DTNB，在渦旋儀上充分振蕩后于室溫（25℃）孵育1 h，將孵育完成后的樣品滴入透明的96孔板中，在412 nm波長處測定吸光度。巰基含量按下式計算：

式中：C0為巰基含量/（mol/g）；A為412 nm波長處的吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（molgcm））；D為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.3.6差示掃描量熱法

參考Vieira等方法并加以修改。差示掃描量熱法是了解生物系統(tǒng)在原生狀態(tài)下熱活動的有利工具。將3種肉的肌漿蛋白溶液置于凍干機中凍干，然后分別稱取樣品15 mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒作參比，保護氣為氮氣，升溫速率8℃/min，溫度范圍20～110℃。

1.3.4蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性分析

參照Kristinsson等的方法并加以修改。利用6.0 mol/L的鹽酸胍溶液將3種肌漿蛋白質(zhì)量濃度調(diào)到1 mg/mL后混合均勻，于25℃（室溫）測定樣品不同時間點的吸光度，測定范圍為200～310 nm。由于構(gòu)象變化速率可以更直觀地反映蛋白質(zhì)構(gòu)象柔順性，構(gòu)象變化速率按下式計算：

1.3.5肌漿蛋白界面行為及乳化性質(zhì)分析

1.3.5.1蛋白界面吸附動力學

參考Gao Zhiming等方法，取大豆油500 mL，加入15 mL的Florisil吸附劑，攪拌30 min后，在5 000hg離心20 min；取出離心后的上清液繼續(xù)加入吸附劑，重復上述操作3次即得到純化后的大豆油。利用界面流變儀測定純水的動態(tài)界面張力，直到30 min內(nèi)界面張力值下降不超過0.5 mN/m即滿足要求。純化后的大豆油密度為0.917 5 g/cm3，純水與純化后大豆油的界面張力為（26.5f0.5）mN/m。

實驗過程中通過分析肌漿蛋白的界面張力（π）隨著吸附時間的變化表征肌漿蛋白的界面吸附行為。測定在室溫下進行，U形針浸入樣品槽，樣品槽放入25 mL相應的肌漿蛋白溶液（0.2 mg/mL），并通過馬達控制形成10μL大小的油滴，測定時間為10 800 s。測試過程中，外界不應有較大的振動，以免對測定造成較大的干擾。

1.3.5.2肌漿蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性

參照李偉偉的方法并加以修改。

乳化活性：將3種肌肉的肌漿蛋白質(zhì)量濃度稀釋到1 mg/mL，然后加入30%體積的大豆油，在8 000 r/min轉(zhuǎn)速下剪切2 min后，從底部取20μL的乳化液置于50 mL離心管中，再加入1%的SDS溶液稀釋100倍，利用渦旋儀振動5 s后，在500 nm波長處測吸光度。

乳化穩(wěn)定性：將上述制得的乳液在4℃靜置10 min后，從底部取20μL乳化液重復上述操作，在500 nm波長處測定吸光度。乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性的計算公式如下：

式中：T為濁度，T=2.303hA0；A0為500 nm波長處的吸光度；A10min為樣品靜置10 min時在500 nm波長處的吸光度，DF為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為光路徑1 cm；θ為油所占比例0.2。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用4次重復實驗的平均值利用SPSS 22.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并用Origin 8.0作圖。

2結(jié)果與分析

2.1 3種肉肌漿蛋白的氨基酸組成分析

表1不同種類肉中肌漿蛋白的氨基酸含量

氨基酸的組成及排列順序影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)特性、生化活性以及加工特性。有些氨基酸有較強的疏水性，因此這些氨基酸很大程度上會增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，進而對蛋白質(zhì)的功能特性產(chǎn)生影響。因此，蛋白質(zhì)在油-水界面穩(wěn)定性的諸多影響因素中，蛋白質(zhì)暴露于界面的氨基酸組成不容忽視，特別是苯丙氨酸和酪氨酸這些疏水性極強的氨基酸，對保持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)也起著重要作用。從表1可以發(fā)現(xiàn)，雞肉肌漿蛋白中這兩種氨基酸含量最高，且與其他兩種肌肉肌漿蛋白間有顯著性差異（P＜0.05）。

2.2肌漿蛋白的基本理化指標測定結(jié)果分析

表2不同種類肉肌漿蛋白理化指標的測定結(jié)果

蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)涉及到蛋白質(zhì)在極性不同的兩相之間產(chǎn)生的作用，對于研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)等具有重要意義。影響蛋白質(zhì)在油-水界面上吸附的因素有很多，主要是蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其序列分布、形狀、分子粒徑、構(gòu)象、表面疏水性、電荷大小等。

溶解度是反映蛋白質(zhì)溶液狀態(tài)和聚集程度的重要參數(shù)，肌肉蛋白質(zhì)的溶解度是指在特定的提取條件下溶解于水溶液中的原蛋白質(zhì)百分比，它是溶質(zhì)（蛋白質(zhì)）和溶劑（水）之間平衡的表現(xiàn)，如表2所示，對于相同條件提取的蛋白，魚肉肌漿蛋白溶解度顯著最大達到（16.74f0.39）mg/mL（P＜0.05），而豬肉肌漿蛋白與雞肉肌漿蛋白均在9.5～10.6 mg/mL之間，后面的二者間溶解度無顯著差異（P＞0.05）。從粒徑的角度看，大粒徑極大可能在空間產(chǎn)生位阻，進而削弱表面疏水性的提高帶來的擴散速率增加。雞肉肌漿蛋白的粒徑為（231.7f7.74）nm，相對稍大于其他兩種肌漿蛋白，但是整體無顯著差異（P＞0.05），這一現(xiàn)象與吸附動力學具有理論關(guān)聯(lián)性。蛋白質(zhì)電位是衡量體系穩(wěn)定性的重要指標，因為它不僅反映顆粒所帶電荷的大小，而且還能表征顆粒間相互作用的強弱，Zeta電位越高，即所帶電荷數(shù)越多，體系就越穩(wěn)定。

3種肉肌漿蛋白Zeta電位分別為（-12.65f1.39）、（-13.64f1.57）、（-15.64f1.99）mV左右，其中魚肉肌漿蛋白的Zeta電位相對于其他兩種蛋白顯著較高（P＜0.05），Zeta電位不僅影響著肌漿蛋白質(zhì)分子間的相互作用，而且在蛋白質(zhì)的凝膠及乳化方面也有著顯著性的影響。不同肉類肌漿蛋白間表面疏水性的差異可能是由于其氨基酸組成、亞基組成和蛋白構(gòu)象不同所導致，由于蛋白質(zhì)中苯丙氨酸和酪氨酸的疏水性極強，而由表1可知，雞肉肌漿蛋白中這兩種氨基酸含量都要高于其他兩種肌漿蛋白，所以這也很好地解釋了雞肉肌漿蛋白的表面疏水性在3種肌漿蛋白中最大。

表面疏水性同時又與其他指標有著密不可分的關(guān)系，例如熱變性溫度，因為適當?shù)臒崽幚頃斐杉{蛋白內(nèi)部疏水基團暴露在蛋白質(zhì)表面，從而使蛋白質(zhì)的表面疏水性增強，這樣就可以改善蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。3種肌漿蛋白熱變性溫度都較低，在40～55℃之間，其中魚肉肌漿蛋白變性溫度最高而豬肉肌漿蛋白最低，且豬肉肌漿蛋白熱變性溫度與雞肉和魚肉間差異顯著（P＜0.05），而雞肉與魚肉肌漿蛋白間的變性溫度無顯著性差異。所以在肌漿蛋白的研究中，如何根據(jù)不同蛋白的變性溫度差異，準確控制熱處理的強度至關(guān)重要，本研究可給蛋白變性凝聚組裝類的研究提供基礎數(shù)據(jù)的參考。