為了探明無(wú)機(jī)鹽穩(wěn)定化脂肪酶的潛在機(jī)理，該文以小麥胚芽脂肪酶為研究對(duì)象，基于界面酶學(xué)的分析方法，研究添加濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+的氯化物對(duì)小麥胚芽脂肪酶存在的油-水界面特性的影響。結(jié)果表明，當(dāng)小麥胚芽脂肪酶體系濃度為1.7×10-6mol/L時(shí)，一價(jià)金屬中Na+更有利于抑制油-水界面的表面張力（P＜0.05），對(duì)麥胚脂肪酶存在時(shí)的油水界面特性影響也較大；二價(jià)金屬離子Ca2+對(duì)界面張力的影響趨勢(shì)與一價(jià)離子不同，在高濃度時(shí)反而增加界面張力；當(dāng)油水界面上存在脂肪酶的催化底物（三油酸甘油酯）和產(chǎn)物（油酸）時(shí)，添加濃度分別為10-6、10-6、10-4和10-9mol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+均可一定程度上降低油水界面張力，從而降低麥胚脂肪酶的作用效果，三油酸甘油酯存在時(shí)Mg2+的作用效果最明顯（P＜0.05），油酸存在時(shí)Na+的作用效果最明顯（P＜0.05）。綜上，無(wú)機(jī)鹽金屬離子主要通過(guò)影響麥胚脂肪酶在油水界面的聚集行為及底物結(jié)構(gòu)狀態(tài)起到鈍化麥胚脂肪酶的作用，該結(jié)果可為麥胚脂肪酶存在時(shí)界面的活性調(diào)控及麥胚的穩(wěn)定化處理提供參考。

0引言

小麥胚芽是小麥加工的主要副產(chǎn)物之一，約占整個(gè)小麥籽粒的2.5%～3.0%。小麥胚芽營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)的天然寶庫(kù)”。全球每年5.5億t小麥產(chǎn)量中，大約可產(chǎn)出100萬(wàn)t功能性油脂和300萬(wàn)t蛋白質(zhì)，但目前有效利用率卻不足10%，主要是因?yàn)樾←溑哐恐泻胸S富的脂肪酶，在其作用下脂肪極易水解，導(dǎo)致小麥胚芽的酸敗變質(zhì)，為此，小麥胚芽穩(wěn)定化是當(dāng)前備受關(guān)注的課題。

小麥胚芽脂肪酶（LA，lipase A）是一種兩親性且具有界面活性的蛋白分子，只能作用于油水界面，該界面不僅是LA催化反應(yīng)的關(guān)鍵場(chǎng)所，也是調(diào)控LA催化活性的合適位點(diǎn)。多年來(lái)，學(xué)界關(guān)于油水界面的理解一直局限于所謂“界面性質(zhì)”的模糊認(rèn)識(shí)，并推測(cè)脂肪酶與底物之間的相互作用可能包括靜電吸引，底物的取向性和水合作用等。直到最近，Reis應(yīng)用生物物理學(xué)理論，才首次揭開(kāi)了界面微環(huán)境與脂肪酶催化活性的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。事實(shí)上，脂類(lèi)酶促水解是典型的多相催化反應(yīng)，其反應(yīng)速率和方向取決于界面微環(huán)境的所有組成成分。界面組成所呈現(xiàn)出的特征及其與酶催化效率的關(guān)聯(lián)性，不僅為今后研究脂肪酶界面催化反應(yīng)提供了新方法，也為研究麥胚脂肪酶的鈍化方法開(kāi)辟了新的途徑。

研究表明，全麥粉中添加一定量Na+，可抑制76.7%脂肪酶活力；Na+對(duì)膜結(jié)合脂肪酶活力抑制率達(dá)55%，由此可見(jiàn)，加入金屬離子抑制劑可作為鈍化LA的輔助手段。此外，LA本身并不能決定酶促反應(yīng)的平衡常數(shù)，其催化水解效率依賴(lài)于LA的界面活性以及底物、產(chǎn)物以及抑制劑在界面的擴(kuò)散速率與動(dòng)態(tài)分布。Torcello-Gómez等研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子可與離子化脂肪酸特異性形成某種復(fù)合物，改變脂肪酸溶解性和油水界面的某些性質(zhì)，進(jìn)而影響脂肪酶催化活性。因此，在無(wú)機(jī)鹽作用下，LA所處微環(huán)境發(fā)生改變，勢(shì)必影響界面層（水相）對(duì)LA的吸附和底物在界面層（油相）的定位。此外，各種界面活性分子也會(huì)在界面層產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，如甘油三酯水解產(chǎn)生具有界面活性的二酰甘油、單酰甘油等會(huì)占據(jù)界面層與LA分子發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，或者通過(guò)分子間相互作用使LA構(gòu)象發(fā)生變化。上述兩種作用機(jī)制都可能對(duì)LA的催化效果產(chǎn)生影響。因此，對(duì)油水界面特性的深入研究與充分認(rèn)識(shí)，將有助于發(fā)現(xiàn)新的LA活力調(diào)控方式。

目前，有關(guān)金屬離子對(duì)LA影響作用的研究中，一般涉及無(wú)機(jī)鹽對(duì)LA活性、結(jié)構(gòu)等影響方面的研究，而金屬離子是否會(huì)對(duì)麥胚LA存在時(shí)油水界面特性產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響LA的催化活性尚停留在推斷階段?；谏鲜霈F(xiàn)狀，本研究基于界面酶學(xué)分析方法，研究不同濃度的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對(duì)麥胚LA、麥胚LA+三油酸甘油酯和麥胚LA+油酸3種不同油水界面模型的影響，以期從界面特性角度分析Na+、K+、Ca2+、Mg2+4種金屬離子對(duì)麥胚LA催化功能的影響機(jī)制，為小麥胚芽穩(wěn)定化方法的建立提供理論研究依據(jù)。

1、材料與方法

1.1材料與儀器

麥胚LA（產(chǎn)品編號(hào)L3001）、單油酸甘油酯，購(gòu)自美國(guó)Sigma有限公司；癸烷，純度99%，購(gòu)自英國(guó)Alfa Aesar A Johnson Matthey公司；油酸、三油酸甘油酯、NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

界面張力儀，芬蘭Kibron公司；AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀，美國(guó)TA Instruments公司；ED-F12標(biāo)準(zhǔn)型加熱水浴槽循環(huán)器，德國(guó)Julabo公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1界面張力測(cè)定

采用吊片法測(cè)定麥胚LA油水界面的張力。界面張力結(jié)果為3次測(cè)量的平均值，試驗(yàn)溫度為25.0±0.1℃。計(jì)算公式如下：

F=mg+2γ(L+d)cosθ（1）

式中F為鉑片所受拉力，N，m為鉑片質(zhì)量，kg；g為重力加速度，m/s2；L為鉑片長(zhǎng)度，m；d為鉑片厚度，m；γ為表面張力，N/m；θ為接觸角，(°)。由于d＜＜L，所以F=mg+2γLcosθ。

1.2.2界面流變性質(zhì)的測(cè)定

利用配有Du Nouy環(huán)系統(tǒng)的AR-G2旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行測(cè)定，具體操作如下：1）將20 mL磷酸鹽緩沖溶液加入樣品杯；2）把盤(pán)放置在珀?duì)栙N平板上的定位環(huán)內(nèi)；3）降下機(jī)頭直至環(huán)定位與液體上表面的平面；4）將約5 mL癸烷均勻地加入到水樣表面，至完全浸沒(méi)Du Nouy環(huán)；5）在振蕩模式下，選擇“Strain sweep step”，測(cè)試頻率為1Hz時(shí)，油水界面的流變性質(zhì)，選擇G'（儲(chǔ)能模量）和G''（損耗模量）呈線(xiàn)性變化區(qū)間內(nèi)的應(yīng)變（strain）值，進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。選擇“Frequency sweep step”，測(cè)試25℃、特定Strain下、頻率0.1～3 Hz區(qū)間內(nèi)16個(gè)點(diǎn)的界面流變性質(zhì)；6）程序設(shè)定完成后，測(cè)定界面剪切彈性模量和界面剪切黏度等。

1.2.3不同濃度麥胚LA存在的界面模型構(gòu)建

以癸烷為油相、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值=7.0）為水相，建立油水界面模型，同時(shí)分別添加1.70×10-8～1.70×10-6mol/L的麥胚LA到水相，研究不同濃度的麥胚LA對(duì)油水界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.4不同種類(lèi)與濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)麥胚LA界面特性的影響

以NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無(wú)機(jī)鹽的形式向油水界面模型水相中分別添加4種金屬離子，研究濃度介于1.0×10-9～1.0×10-2mol/L間的NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2對(duì)麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.2.5不同濃度三油酸甘油酯對(duì)界面組成與結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設(shè)定油水界面模型油相中三油酸甘油酯的濃度分別為1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3和1×10-2mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測(cè)定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度三油酸甘油酯對(duì)油水界面組成與結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.6不同濃度水解產(chǎn)物（油酸）對(duì)界面組成與結(jié)構(gòu)的影響

根據(jù)1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，固定磷酸鹽緩沖溶液中麥胚LA濃度，設(shè)定油水界面模型油相中油酸的濃度為5×10-6、5×10-5、5×10-4、5×10-3、5×10-2和5×10-1mol/L，分別按照1.2.1、1.2.2中的方法測(cè)定界面張力、界面流變參數(shù)。分析不同濃度水解產(chǎn)物對(duì)油水界面組成與結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.7底物或產(chǎn)物存在時(shí)，無(wú)機(jī)鹽對(duì)麥胚LA界面特性的影響

參考1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，在每種無(wú)機(jī)鹽的不同研究濃度范圍內(nèi)，選取對(duì)麥胚LA界面張力和界面流變性質(zhì)影響較大的某一濃度，同時(shí)按照1.2.5、1.2.6的試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)界面特性影響最大時(shí)的三油酸甘油酯和油酸的濃度，研究有底物或產(chǎn)物存在時(shí)，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl24種無(wú)機(jī)鹽對(duì)麥胚LA界面張力和界面流變特性的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值。采用Minitab進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)間差異性以95%置信區(qū)間（P＜0.05）來(lái)說(shuō)明。