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神經(jīng)元鈣傳感蛋白(NCS1)的膜結(jié)合性能研究【下】

來源:上海謂載 瀏覽 1792 次 發(fā)布時(shí)間:2022-07-06

關(guān)于脂肪?;?,除DPPE外,在存在不飽和脂質(zhì)(DO和DD)的情況下觀察到的MIP值大于在三個(gè)極性頭基的飽和脂質(zhì)(DP和DS)下觀察到的MIP值。不飽和脂質(zhì)比飽和脂質(zhì)更具流動性和動態(tài)性,mNCS1與這種構(gòu)象的相互作用更好。事實(shí)上,DP和DS單分子膜中不存在不飽和現(xiàn)象會導(dǎo)致液體冷凝物理狀態(tài),其中疏水性脂肪?;溄M織良好,極性頭基密集[53]。此外,在DOPS存在下觀察到的MIP值可以通過mNCS1對其不飽和脂肪酰基鏈的更好的結(jié)合相互作用來解釋,而不是PS的潛在排斥作用。同樣,在飽和磷脂存在下的協(xié)同值小于在不飽和磷脂存在下觀察到的協(xié)同值。事實(shí)上,在不飽和脂肪酰基鏈存在下觀察到的協(xié)同值在0.25±0.03和0.43±0.04之間。此外,在DDPC和DDPE存在下觀察到的協(xié)同值分別大于在DOPC和DOPE存在下觀察到的協(xié)同值。mNCS1似乎優(yōu)先結(jié)合長的不飽和脂肪?;?。這些數(shù)據(jù)表明,mNCS1將優(yōu)先結(jié)合由不飽和磷脂組成的生理膜結(jié)構(gòu)域。然而,在DO脂肪?;湸嬖诘那闆r下觀察到的協(xié)同值與其他關(guān)于極性頭基的協(xié)同值不遵循相同的趨勢。事實(shí)上,PS脂質(zhì)單層的協(xié)同值更大,PC和PE脂質(zhì)單層的協(xié)同值降低。這一觀察結(jié)果可以用PO脂肪酰基鏈的獨(dú)特構(gòu)型來解釋。事實(shí)上,它們由一個(gè)順式雙鍵組成,該雙鍵導(dǎo)致剛性曲率[71],導(dǎo)致mNCS1以比PC和PE更大的協(xié)同作用與PS脂質(zhì)單分子膜結(jié)合。


因此,如第2.3節(jié)所述,在不同i下存在摻雜單層的情況下,使用以下適用于Pitcher[50]表面壓力測量的拉伸指數(shù)方程對mNCS1進(jìn)行了吸附動力學(xué)擬合。如表S2所示,摻雜單分子層中mNCS1的吸附速率從0.074s下降?1至0.003秒?1當(dāng)初始表面壓力從5.0 mN/m增加到29.3 mN/m時(shí)。在這些條件下,速率系數(shù)隨著i值的增加而增加,正如之前用另一種蛋白質(zhì)觀察到的那樣[72]。因此,在DOPE、DOPS和DPPE單分子膜存在的情況下,以近似相同的i值(約16 mN/m)計(jì)算了mNCS1的速率系數(shù)(表S3)。在摻雜單分子膜(0.069 s)存在下,速率系數(shù)更高?1)比用DOPS單分子膜觀察到的結(jié)果(0.030s?1)這高于用DPPE單分子膜觀察到的結(jié)果(0.002秒?1).這一觀察結(jié)果意味著,除了MIP和synergy的高值外,DOPE對蛋白質(zhì)的吸附比DOPS或DPPE更快。


先前的數(shù)據(jù)表明,約5%的突觸體NCS1定位于Triton X-100提取后獲得的耐去污劑膜(DRM)[43]。然而,其余95%的定位尚未確定。mNCS1可能主要定位于由不飽和磷脂組成的膜結(jié)構(gòu)域,尤其是那些含有PE極性頭基的膜結(jié)構(gòu)域。


3.1.2.缺鈣對mNCS1膜結(jié)合的影響


mNCS1與鈣的結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化、C末端片段的擠出和大的疏水裂縫的暴露[23,24]。這些變化可能與mNCS1的膜結(jié)合有關(guān)。以前的數(shù)據(jù)表明,在有鈣和無鈣的情況下,NCS1與膜的結(jié)合不同[73]。事實(shí)上,鈣濃度的升高穩(wěn)定了膜上mNCS1的補(bǔ)充部分。NCS1對鈣具有納摩爾親和力(90 nM)[44],因此在存在1 mM鈣時(shí)處于鈣結(jié)合構(gòu)象。在乙二醇四乙酸(EGTA)存在下也進(jìn)行了膜結(jié)合測量,EGTA是鈣離子的螯合劑。在EGTA存在下,mNCS1的EF-hand基序不能結(jié)合可能存在的鈣,蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變?yōu)闊o鈣形式。因此,在四種不同磷脂(DPPS、DPPE、DOPS和DOPE)存在的情況下,評估了鈣和磷脂組成對mNCS1膜結(jié)合的影響。以下數(shù)據(jù)說明了在鈣存在下mNCS1的構(gòu)象變化以及這種變化對其膜結(jié)合的影響。

圖5.在無鈣(白色)和有鈣(灰色)的情況下,mNCS1與DPPS、DPPE、DOPS和DOPE的MIP(A)和協(xié)同作用(B)值。MIP和synergy值的不確定性如第2.3節(jié)所述計(jì)算。


在沒有鈣的情況下,mNCS1采用無鈣構(gòu)象,其結(jié)合膜的方式與存在鈣的情況不同。圖5比較了在存在和不存在鈣的情況下獲得的mNCS1的MIP和synergy值(數(shù)值見表S4)。當(dāng)mNCS1不與鈣結(jié)合時(shí),MIP值大于存在鈣的情況。事實(shí)上,在沒有鈣的情況下,所有MIP值都在30 mN/m以上,這表明當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與鈣結(jié)合時(shí),該蛋白質(zhì)能夠與任何膜蛋白結(jié)合。在沒有鈣的情況下,協(xié)同值也相當(dāng)高,表明mNCS1和膜之間有很強(qiáng)的協(xié)同作用,無論其成分如何。DPPE、DOPS和DOPE單分子膜缺鈣對結(jié)合參數(shù)的影響很小,分別使MIP增加5.57、2.28和4.16 mN/m,協(xié)同效應(yīng)分別增加0.16、0.00和0.07。無鈣構(gòu)象似乎限制了mNCS1與PE脂質(zhì)單層的膜結(jié)合。然而,在DPPS單層的存在下,MIP值增加了一倍多,從19.3 mN/m增加到42.8 mN/m。此外,在沒有鈣的情況下觀察到巨大的協(xié)同值增加。實(shí)際上,協(xié)同價(jià)值從?0.12至0.47,表明mNCS1的無鈣構(gòu)象應(yīng)隱藏其負(fù)電荷,并消除該單層與蛋白質(zhì)之間的排斥作用(圖4)。mNCS1的負(fù)電荷殘基應(yīng)埋在無鈣構(gòu)象中,并暴露在鈣結(jié)合構(gòu)象中,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)排斥。在DOPS存在的情況下,協(xié)同值從0.38降低到無鈣的情況下的0.23。DO脂肪?;湹莫?dú)特構(gòu)型可以解釋這一數(shù)據(jù)。然而,在沒有鈣的情況下,MIP和協(xié)同值相當(dāng)高,并且應(yīng)允許mNCS1與由DOP組成的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合。


先前的數(shù)據(jù)表明,鈣對兩種形式的蛋白質(zhì)都有外在的穩(wěn)定作用[74]。事實(shí)上,在沒有鈣的情況下,mNCS1和nmNCS1的穩(wěn)定性顯著降低,但在有鈣的情況下,平衡轉(zhuǎn)變是完全可逆的。然而,這些研究是在沒有脂質(zhì)單層的情況下進(jìn)行的。在缺乏鈣和磷脂的情況下,NCS1的結(jié)構(gòu)可能會不穩(wěn)定,但在磷脂單分子膜的存在下,這種趨勢可能會逆轉(zhuǎn)。事實(shí)上,兩種形式的NCS1在沒有鈣的情況下的MIP值都更大,這表明在沒有鈣的情況下,蛋白質(zhì)與膜強(qiáng)烈相互作用。這一觀察結(jié)果支持了這樣一個(gè)事實(shí),即在沒有鈣的情況下,蛋白質(zhì)與膜緊密結(jié)合,而在有鈣的情況下,構(gòu)象變化減少了這種相互作用,這肯定有利于那些具有不同底物的蛋白質(zhì)。


在沒有鈣的情況下進(jìn)行的測量可以表征鈣和mNCS1構(gòu)象的存在對其膜結(jié)合的影響。然而,為了確定最終的肉豆蔻酰鈣開關(guān),對非肉豆蔻?;鞍譶mNCS1進(jìn)行了相同的測量。


3.2.是否存在鈣-肉豆蔻酰開關(guān)?


3.2.1.肉豆蔻?;贜CS1膜結(jié)合中的作用


NCS家族蛋白質(zhì)的N-末端甘氨酸是?;腫8-10]。這種?;赡茉谶@些蛋白質(zhì)的生理功能中發(fā)揮重要作用。mNCS1的?;侨舛罐Ⅴ;?,是一個(gè)沒有雙鍵的14碳鏈。一些NCS蛋白質(zhì)具有鈣-肉豆蔻基開關(guān),這是一種動態(tài)機(jī)制,允許在鈣存在的情況下擠出肉豆蔻基。然而,如引言所述,NCS1的這種機(jī)制存在爭議。因此,使用不含肉豆蔻酰基的蛋白質(zhì)nmNCS1進(jìn)行了結(jié)合膜測量,以表征不存在這種酰化對其膜結(jié)合的影響。


圖6比較了在有鈣和無鈣的情況下mNCS1和nmNCS1的MIP值(數(shù)值見表S5)。在鈣存在或不存在的情況下,用nmNCS1觀察到的MIP值與觀察到的四種磷脂的mNCS1的MIP值沒有顯著差異。因此,肉豆蔻?;拇嬖谒坪踉阝}存在下蛋白質(zhì)的膜結(jié)合中不起關(guān)鍵作用。這些觀察結(jié)果表明,NCS1中不存在肉豆蔻酰鈣開關(guān)。事實(shí)上,另兩種非肉豆蔻酰化和肉豆蔻?;问降腘CS蛋白質(zhì)VILIP-1和VILIP-3的MIP值之間的巨大差異突顯了這種機(jī)制的存在[35]。在鈣與DOPC/DOPS單層(3:1)的存在下觀察到了這些差異。在不同的磷脂單分子膜中觀察到recoverin(另一種NCS蛋白質(zhì))的MIP值存在差異,無論是否具有肉豆蔻?;饔?,這些磷脂單分子膜突出了這種蛋白質(zhì)的肉豆蔻酰鈣開關(guān)(C.Salese,未發(fā)表的結(jié)果)。此外,肉豆蔻?;拇嬖谠黾恿薔CS1的鈣協(xié)同度[24]。事實(shí)上,mNCS1與鈣的結(jié)合比nmNCS1更強(qiáng),3個(gè)鈣離子與mNCS1結(jié)合,而nmNCS1只有2個(gè)。然而,這種區(qū)別不會導(dǎo)致鈣存在時(shí)nmNCS1的不同膜結(jié)合。

圖6.nmNCS1(白色)和mNCS1(灰色)的MIP值,在不存在鈣(A)和存在鈣(B)的情況下,具有DPPS、DPPE、DOPS和DOPE。MIP值的不確定性如第2.3節(jié)所述計(jì)算。


還觀察到肉豆蔻酰化和非肉豆蔻?;疺ILIP-3之間的吸附動力學(xué)差異。然而,鈣存在下nmNCS1的吸附動力學(xué)與mNCS1的吸附動力學(xué)相似。事實(shí)上,在DOPE、DOPS和DPPE存在的情況下,計(jì)算了nmNCS1的速率系數(shù)(表S3)。如mNCS1所觀察到的,在摻雜單分子膜(0.069 s)存在時(shí),速率系數(shù)更高?1)比用DOPS單分子膜觀察到的結(jié)果(0.061s?1)這高于用DPPE單分子膜觀察到的結(jié)果(0.003秒?1)對于nmNCS1。這一觀察結(jié)果表明,無論肉豆蔻?;c否,DOPE對蛋白質(zhì)的吸附都比DOPS或DPPE更快。肉豆蔻酰化基團(tuán)的缺失不會顯著影響蛋白質(zhì)對不同磷脂單分子膜的吸附速率。在鈣存在的情況下,mNCS1和nmNCS1的相似MIP值和速率系數(shù)表明,NCS1沒有鈣-肉豆蔻酰開關(guān),正如幾位作者所提出的[29,37,38,41]。


當(dāng)NCS蛋白質(zhì)具有鈣-肉豆蔻酰開關(guān)時(shí),肉豆蔻?;鶊F(tuán)在膜結(jié)合中起關(guān)鍵作用[30-35,75-77]。然而,NCS1的肉豆蔻?;赡芫哂谐そY(jié)合之外的另一種作用。事實(shí)上,以前的研究表明,肉豆蔻?;鶊F(tuán)可能在蛋白質(zhì)的展開/復(fù)性中發(fā)揮結(jié)構(gòu)作用[74]。這一功能在很大程度上取決于鈣,這可以解釋在有無鈣的情況下觀察到的差異。mNCS1和nmNCS1的相似MIP值表明,肉豆蔻?;粎⑴c鈣-肉豆蔻?;_關(guān)或膜結(jié)合,而是參與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)作用。因此,需要研究一種類似于N-末端片段的肽,以試圖解釋該片段的作用,該片段似乎不涉及鈣-肉豆蔻酰開關(guān)。


3.2.2.N-末端片段在鈣存在下NCS1膜結(jié)合中的作用


NCS1的N-末端片段參與蛋白質(zhì)與磷脂酰肌醇4-激酶相互作用的功能[46]。然而,關(guān)于最終參與膜結(jié)合的信息尚未描述。因此,使用類似于NCS1 N末端片段的肽進(jìn)行了膜結(jié)合測量。該肽由以下33個(gè)殘基組成:gksnsklkpevveeltrktyftekevqwykgf。由于脯氨酸的存在,該肽是肉豆蔻?;模蓛蓚€(gè)螺旋和一個(gè)環(huán)組成(圖S1)。首先,已確定肽的飽和濃度為9g/mL。然后,在鈣存在的情況下,對之前研究的12種不同磷脂與整個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合膜測量。

圖7.在鈣存在下,使用DPP、DSP、DOPS、DDPS、DPPC、DSPC、DOPC、DOPC、DDPC、DPPE、DSPE、DOPE、DOPE和DDPE的單層的N-末端肽的MIP(A)和協(xié)同作用(B)值。MIP和synergy值的不確定性如第2.3節(jié)所述計(jì)算。


圖7比較了有無鈣時(shí)mNCS1和nmNCS1的MIP值(數(shù)值見表S6)。在PC或PE脂質(zhì)單分子膜存在下觀察到的所有MIP值均高于30 mN/m,表明肽可以優(yōu)先結(jié)合由兩性極性頭基組成的磷脂。所有這些MIP值相似(31.6和37.7 mN/m之間,DOPE除外),并且沒有顯示出對特定脂肪酰基鏈的明確偏好。在PS脂質(zhì)單分子膜存在下觀察到的MIP值低于30 mN/m,但DOP除外,這可以由DO脂肪酰基鏈的獨(dú)特構(gòu)象來解釋。此外,在存在DP、DS和DD脂肪?;湹那闆r下,PE脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值高于PC和PS脂質(zhì)單分子膜的協(xié)同值。在DS脂肪?;湹那闆r下,用PE脂質(zhì)單層觀察到的協(xié)同值低于用PC觀察到的協(xié)同值,但優(yōu)于用PS觀察到的協(xié)同值。這些趨勢表明,N端肽參與了整個(gè)蛋白質(zhì)與由PE脂質(zhì)單層組成的磷脂的優(yōu)先結(jié)合。此外,關(guān)于脂肪?;湥瑳]有明顯的趨勢。事實(shí)上,在不飽和磷脂與聚苯乙烯的存在下觀察到更高的協(xié)同值,而在聚碳酸酯中觀察到相反的趨勢。除DOPE外,在PE中觀察到的所有協(xié)同值都很高。因此,這些數(shù)據(jù)表明,除了其N末端片段外,蛋白質(zhì)的其他結(jié)構(gòu)域也參與了膜結(jié)合。此外,在DOPE、DOPS和DPPE存在的情況下,計(jì)算了N端肽的速率系數(shù)(表S3)。速率系數(shù)比完整蛋白質(zhì)慢并且相對恒定(0.001 s?1,0.002秒?1和0.003秒?1分別為DOPE、DOPS和DPPE單層)。這一結(jié)果表明,NCS1的其他結(jié)構(gòu)域參與了蛋白質(zhì)與脂質(zhì)單層的相互作用速度。


盡管用N-末端肽觀察到的趨勢不太明顯,但這些數(shù)據(jù)與用mNCS1觀察到的結(jié)果一致。因此,N末端片段可以像蛋白質(zhì)的其他片段一樣與膜相互作用。為了更好地了解其參與mNCS1的膜結(jié)合,使用在線工具Heliquest分析了N-末端序列[78]。該工具可以預(yù)測兩親性肽的二級結(jié)構(gòu)[79]。其算法檢測至少五個(gè)相鄰殘基的不間斷疏水表面的存在。如果存在這樣的面,則驗(yàn)證面殘留物是否為極性。螺旋輪中N-末端肽的氨基酸序列的投影如圖8A所示。大多數(shù)帶電殘基(紅色為正,藍(lán)色為負(fù))位于親水面上,并可能與膜的極性頭基團(tuán)相互作用。此外,大多數(shù)疏水殘基(黃色)位于螺旋的另一面,并可能與脂肪酰基鏈相互作用。這個(gè)組織可以解釋在12個(gè)研究中觀察到的9個(gè)磷脂的MIP非常高的值。NCS1的N-末端片段似乎參與了NCS1膜結(jié)合。其疏水殘基與脂肪?;溝嗷プ饔?,而其親水殘基與極性頭基相互作用,如圖8B所示。這種參與應(yīng)該解釋NCS1的N末端片段在膜結(jié)合中的重要性,從而解釋肉豆蔻基的微弱影響。

圖8.(A)使用在線工具Heliquest[78]建立的N-末端肽的螺旋輪表示法。顏色代碼如下:疏水殘基為黃色,絲氨酸和蘇氨酸為紫色,堿性殘基為藍(lán)色,酸性殘基為紅色,天冬酰胺和谷氨酰胺為粉紅色,脯氨酸為綠色,其他殘基為灰色。(B)在存在脂質(zhì)單層的情況下N-末端肽的方向的圖示。使用與(A)相同的顏色代碼(為了解釋本圖例中對顏色的引用,讀者請參閱本文的web版本)。


4、結(jié)論


在mNCS1存在下進(jìn)行的膜結(jié)合測量表明,由PE極性頭基和不飽和脂肪?;溄M成的磷脂具有更好的結(jié)合相互作用。這些數(shù)據(jù)說明了NCS1參與神經(jīng)退行性疾病的原因。事實(shí)上,大多數(shù)神經(jīng)干細(xì)胞蛋白參與了由鈣調(diào)節(jié)失調(diào)引起的神經(jīng)退行性疾病[8,80-83]。NCS1在精神分裂癥[84]、雙相情感障礙[85]、帕金森病[86]和阿爾茨海默病[87]患者的前額葉皮層上調(diào)。在精神分裂癥[88,89]、阿爾茨海默病[90]和帕金森病[91,92]患者的大腦中觀察到多不飽和脂肪酸濃度下降。此外,發(fā)現(xiàn)較少的PE脂質(zhì)單層有利于PS脂質(zhì)單層。然而,PS極性頭基團(tuán)帶負(fù)電,應(yīng)會對NCS1的膜結(jié)合及其功能產(chǎn)生巨大影響。此外,由于鈣的存在而引起的構(gòu)象變化顯著影響NCS1膜結(jié)合。事實(shí)上,在鈣存在的情況下,NCS1的膜結(jié)合較弱,這表明蛋白質(zhì)發(fā)生了重組,以更好地與其底物相互作用。肉豆蔻酰基的存在對NCS1的膜結(jié)合影響很小,表明該蛋白質(zhì)中缺乏鈣-肉豆蔻?;_關(guān)機(jī)制。肉豆蔻酰化可能在NCS1的折疊/去折疊中起到所需的結(jié)構(gòu)作用。最后,N末端肽由兩個(gè)參與NCS1膜結(jié)合的兩親螺旋組成。這些結(jié)果證實(shí)了文獻(xiàn)中觀察到的一些數(shù)據(jù),但尚未解釋。事實(shí)上,他們認(rèn)為NCS1沒有鈣-肉豆蔻酰開關(guān),正如幾位作者先前提出的[29,37,38]。NCS1首先出現(xiàn)在進(jìn)化過程中[40],鈣-肉豆蔻酰開關(guān)可能只出現(xiàn)在NCS家族的新成員中。事實(shí)上,之前已經(jīng)確定N-末端片段中的殘基阻止了肉豆蔻基擠出[29]。假設(shè)在進(jìn)化過程中發(fā)生了突變,以允許某些NCS蛋白質(zhì)中存在這種機(jī)制[29,93]。為了驗(yàn)證這一假設(shè),目前正在對NCS1突變體進(jìn)行膜結(jié)合測量。


致謝


作者感謝Habib Horchani博士和Dre Alicia Montoni博士參與科學(xué)討論和校對。SL是加拿大自然科學(xué)與工程研究委員會(NSERC)本科生研究獎的獲得者。作者感謝NSERC和魁北克杜楚德基金會的資助。


附錄A.補(bǔ)充數(shù)據(jù)

與本文相關(guān)的補(bǔ)充數(shù)據(jù)可在以下網(wǎng)站的在線版本中找到:http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2015.11.65

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