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疏水劑HFBⅡ和乳清蛋白組成的混合體系中的表面流變學(xué)與泡沫歧化穩(wěn)定性的關(guān)系——結(jié)果和討論、結(jié)論、致謝

來源:上海謂載 瀏覽 1549 次 發(fā)布時(shí)間:2022-02-08

3.結(jié)果和討論


3.1.分層


為了了解空氣/水表面乳清蛋白的存在和數(shù)量如何影響HFBII的表面流變性,第一步是觀察純體系和混合體系的鋪展層。觀察擴(kuò)散層的主要優(yōu)點(diǎn)是表面成分已知,假設(shè)幾乎所有應(yīng)用于界面的蛋白質(zhì)都會(huì)擴(kuò)散并留在界面上。圖1顯示了純HFBII和純?nèi)榍宓鞍准捌浠旌衔锏谋砻鎵毫Φ葴鼐€。正如之前的研究[8,24]所知,與乳清蛋白相比,HFBII使表面壓力急劇上升,其行為更像剛性顆粒,而乳清蛋白則表現(xiàn)出更柔軟、更像聚合物的行為。據(jù)推測(cè),由于乳清蛋白在界面處的構(gòu)象變化,即展開,以及其大分子量,表面壓力在較低的表面負(fù)荷下升高。然而,上升幅度遠(yuǎn)小于HFBII,乳清蛋白達(dá)到的最大表面壓力也較低。關(guān)于混合層的等溫線,可以觀察到,對(duì)于低水平,曲線移動(dòng)到稍大的表面積,曲線的形狀仍然讓人想起純WPI曲線。當(dāng)混合物中HFBII的比例上升到1:1或更高時(shí),曲線的陡度增加,表面壓力開始在較小的表面積處形成。另一個(gè)需要提及的重要事項(xiàng)是,對(duì)于純HFBII,由于HFBII層的2D相變和凝固[11],應(yīng)注意22 mN/m以上的表面壓力值,從而形成具有顯著屈服應(yīng)力的強(qiáng)彈性表面,可維持局部吸附和變形梯度[25]。因此,高于該值時(shí),表面壓力傳感器附近的局部表面變形可能不同于全球平均變形。宏觀上,這也表現(xiàn)在表面上形成褶皺,這也表明了不均勻的變形和應(yīng)力分布,如下所述。

圖1。純蛋白質(zhì)系統(tǒng)WPI(右)和HFBII(左)以及口糧WPI:HFBII為10:1、3:1、1:1、1:3和1:10的混合系統(tǒng)的表面壓力等溫線。


值得注意的是,對(duì)于純HFBII,П–A等溫線在連續(xù)的壓縮膨脹循環(huán)中不會(huì)發(fā)生變化,這再次表明HFBII不可撤銷地附著在界面上,幾乎沒有任何構(gòu)象變化。對(duì)于純WPI和1:1混合物,П–A等溫線略微向較小區(qū)域移動(dòng),這表明由于WPI分子的構(gòu)象變化、多層形成或如前所述,由于WPI的解吸,表面重排的可能性較小。


為了便于比較,從圖1的數(shù)據(jù)中,使用表面壓力第一次上升的斜率(由第一次壓縮產(chǎn)生)和公式E=(?2)提取了表觀膨脹模量(E)??1)/ln(A1/A2)。曲線的斜率總是在表面壓力在15到25 mN/m之間波動(dòng)的表面積范圍內(nèi)確定的。圖2顯示了表觀模量作為混合比的函數(shù),表示為HFBII分?jǐn)?shù)fHFBII=cHFBII/(cHFBII+cWPI)。

圖2。表觀模量作為擴(kuò)散層HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù),以及槽屏障之間界面上褶皺斑塊的圖示。右邊是純HFBII層的一個(gè)褶皺斑的顯微鏡照片。


從圖2中可以看出,HFBII分?jǐn)?shù)高達(dá)0.5的混合層,WPI的存在似乎主導(dǎo)了П15至25 mN/m之間界面處的表面流變行為。僅觀察到表面模量略有增加,此外,觀察到界面完全光滑。從HFBII分?jǐn)?shù)為0.75開始,行為開始顯示HFBII層的特性?;诒碛^模量,從WPI主導(dǎo)行為到HFBII主導(dǎo)行為的轉(zhuǎn)變對(duì)應(yīng)于褶皺斑塊的視覺觀察,這對(duì)于壓力高于22 mN/m的純HFBII層來說是典型的。最后,在純HFBII系統(tǒng)中,斑塊相互連接,并觀察到最高模量,表明已知的HFBII行為。從這些觀察結(jié)果可以清楚地看出,在較低的HFBII/WPI比率下,富HFBII的疇的表面分離,包圍著富WPI的2D相,隨著HFBII比率的增加,這些疇的大小增加,它們變得相互連接,因此在fHFBII=0.6左右時(shí),表面變得以HFBII為主。


3.2.吸附層


發(fā)泡系統(tǒng)的下一步是觀察吸附層。與擴(kuò)散層相反,表面成分未知;只有蛋白質(zhì)的體積比是已知的。此外,表面成分可能會(huì)隨時(shí)間而變化,因?yàn)槌私缑嫔蟇PI可能發(fā)生的構(gòu)象變化外,表面和本體之間的材料連續(xù)交換是可能的。


圖3顯示了表面壓力隨時(shí)間的變化。第一次~100 s后,清潔表面后,屏障仍在膨脹(程序說明見第2.2.2節(jié)),而在實(shí)驗(yàn)開始后100 s至1000 s之間,表面積保持恒定,以允許吸附層形成并平衡。從1000秒開始,界面被壓縮,因此表面壓力增加。與在擴(kuò)展層中觀察到的情況類似(在一個(gè)周期內(nèi),時(shí)間和面積呈線性關(guān)系),純HFBII的表面壓力增加斜率遠(yuǎn)高于純WPI。大約2500秒后,表面再次膨脹,導(dǎo)致表面壓力降低。同樣在混合系統(tǒng)中,表面壓力在1000 s后趨于平穩(wěn)。應(yīng)注意1000 s后平衡表面壓力的絕對(duì)值,因?yàn)樵?2 mN/m以上以HFBII為主的層的情況下,界面變得有彈性,在0秒清潔表面后,可能會(huì)出現(xiàn)皺紋,并且針重新進(jìn)入表面。在清潔界面和針浸入界面之間,可能已經(jīng)吸附了一些蛋白質(zhì)(當(dāng)使用吸附層時(shí),與使用鋪展層相比,校準(zhǔn)表面張力并不容易,因?yàn)槲綄?shí)驗(yàn)并不像使用鋪展層那樣從清潔的純水界面開始)然而,吸附過程中的曲線形狀,壓縮和膨脹提供了有關(guān)吸附層功能的重要信息。從1000秒開始,第一次壓縮開始,在大約2500秒時(shí),接口再次擴(kuò)展。


現(xiàn)在,讓我們討論擴(kuò)散和吸附HFBII和WPI層之間的差異(見圖1和圖3)。擴(kuò)散層和吸附層的吸附等溫線形狀大致相似。主要區(qū)別在于記錄開始時(shí)表面壓力較高。對(duì)于鋪展層,選擇施加蛋白質(zhì)的量,使施加后的表面壓力在第一次壓縮前上升至約1 mN/m。在吸附的情況下,界面上蛋白質(zhì)的數(shù)量,以及表面壓力取決于吸附速率。吸附速率取決于蛋白質(zhì)在本體中的濃度及其表面活性。該濃度選擇得相當(dāng)高(0.1 mg/ml),因此吸附在界面上的蛋白質(zhì)量不會(huì)顯著影響整體蛋白質(zhì)濃度。


同樣在視覺觀察中(見圖5),觀察到了與傳播系統(tǒng)的相似性。照片是從朗繆爾槽中的吸附層和壓縮層拍攝的。觀察到,在HFBII分?jǐn)?shù)為0.33及以上的吸附層中,會(huì)形成典型的HFBII褶皺,這與擴(kuò)散層不同,在擴(kuò)散層中,從fHFBII分?jǐn)?shù)為0.75起觀察到褶皺(重要的是要記住,第一個(gè)是體積中的蛋白質(zhì)比率,第二個(gè)是界面處的蛋白質(zhì)比率)。另一個(gè)區(qū)別是,在吸附系統(tǒng)中,皺紋更多地出現(xiàn)在屏障處的彎月面上,而在擴(kuò)散系統(tǒng)中,皺紋出現(xiàn)在均勻分布在槽區(qū)的斑塊中(見圖2)。

圖5。在液體中不同疏水組分的朗繆爾槽上,HFBII/WPI混合溶液的吸附層照片:a:fHFBII=1,B:fHFBII=0.67,C:fHFBII=0.5,D:fHFBII=0.33。


圖4給出了純系統(tǒng)和一個(gè)混合系統(tǒng)在幾個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)期間的表面壓力等溫線。我們注意到,在該圖中,HFBII和WPI的表面積按擴(kuò)展系統(tǒng)曲線中彎曲點(diǎn)的出現(xiàn)比例縮放(圖1)。已知這一點(diǎn)反映了表面中明顯的緊密堆積轉(zhuǎn)變[8]。第一次壓縮導(dǎo)致的表面壓力的初始上升可以轉(zhuǎn)化為表觀膨脹模量,類似于對(duì)鋪展層所做的,盡管蛋白質(zhì)的總量可能會(huì)因吸附而變化,因此在這種情況下,吸附和表面積是不可互換的。由于表面壓力的絕對(duì)值是未知的,所以決定考慮在壓縮時(shí)表面壓力的第一個(gè)10 Mn/m的上升來計(jì)算模量。圖7(上圖)給出了表觀模量與本體溶液中HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù)關(guān)系。從圖中可以看出,從HFBII分?jǐn)?shù)為0.33或以上的情況來看,吸附層以HFBII為主。這與皺紋的出現(xiàn)是一致的(圖5)。

圖4。?/A-純HFBII、純WPI及其1:10混合物的吸附系統(tǒng)的等溫線,所有這些系統(tǒng)的總蛋白質(zhì)濃度均為0.1 mg/ml。等溫線包括第一個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)和5個(gè)滯后環(huán)。將HFBII和WPI的表面積縮放至攤鋪系統(tǒng)曲線中彎曲點(diǎn)的出現(xiàn),對(duì)應(yīng)于表面的明顯緊密堆積過渡(圖1)。


有趣的是,將吸附層(圖7,頂部)的過渡點(diǎn)與HFBII占主導(dǎo)地位的行為進(jìn)行比較,前者大致介于HFBII(整體)0.2和0.3(圖6)之間,后者大致位于0.6(表面)的擴(kuò)散層(圖2)之間。假設(shè)這種情況發(fā)生在大致相同的表面成分上,這將表明0.2 HFBII:WPI本體成分對(duì)應(yīng)于界面處的0.6 HFBII:WPI,毫不奇怪地證實(shí)HFBII比WPI更具表面活性。當(dāng)然,應(yīng)該注意的是,吸附實(shí)驗(yàn)中存在的HFBII的絕對(duì)量高于擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中的HFBII絕對(duì)量,并且由于來自塊體的額外蛋白質(zhì)吸附,界面處的比率可能會(huì)隨著壓縮/膨脹循環(huán)而改變,如下文所述,可能會(huì)形成多層。

圖6。表觀模量E是WPI和HFBII混合溶液中吸附層HFBII分?jǐn)?shù)的函數(shù)。


當(dāng)仔細(xì)觀察混合吸附層(圖4)的表面壓力等溫線時(shí),很明顯,?/a曲線隨著每個(gè)壓縮循環(huán)向左移動(dòng)(面積較?。兊鞍踪|(zhì)的曲線在第一次膨脹/壓縮循環(huán)后幾乎沒有變化,在第一次膨脹/壓縮循環(huán)中,各層或多或少處于平衡狀態(tài)。純體系的行為可以用這樣一個(gè)事實(shí)來解釋:蛋白質(zhì)實(shí)際上是不可逆地吸附在界面上的(從鋪展層的實(shí)驗(yàn)中也可以清楚地看到)。在膨脹的前幾個(gè)循環(huán)中,更多的蛋白質(zhì)可以吸附在自由表面,直到在最大膨脹點(diǎn)達(dá)到“平衡”。當(dāng)系統(tǒng)被壓縮時(shí),由于蛋白質(zhì)不能解吸,各層被簡(jiǎn)單地壓縮(對(duì)于WPI而言,部分表面展開),并且可能形成一種結(jié)構(gòu),WPII不能完全從界面解吸,而是垂直重新排列,并在富含HFBII的層下方形成第二層。這一假設(shè)用圖7中的圖表和下面的討論加以說明。在接下來的膨脹周期中,一些新的蛋白質(zhì)可以繼續(xù)吸附,但由于現(xiàn)在表面濃度已經(jīng)高于平衡體積濃度,沒有新的蛋白質(zhì)會(huì)被吸附。此外,表面下第二層和靠近開放區(qū)域的WPI可以“翻轉(zhuǎn)”并填充膨脹間隙,比任何新的蛋白質(zhì)從塊體中吸附的速度都快。這樣,就達(dá)到了一種穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7。重復(fù)壓縮和膨脹后HFBII:WPI混合層結(jié)構(gòu)形成示意圖。請(qǐng)注意,乳清蛋白的主要成分BLG僅在此處顯示。壓縮:BLG的一部分從表面排出,形成一個(gè)子層。膨脹:BLG的一部分停留在亞表層,而另一部分可能重新吸附到主層。頂面存在HFBII的凈濃度。


吸附混合系統(tǒng)的行為非常有趣,值得進(jìn)一步討論。?/A等溫線向左移動(dòng)的事實(shí)表明,在逐漸膨脹和壓縮后,該層變得越來越緊密,接近純HFBII的表面覆蓋。這似乎得到了以下事實(shí)的支持:壓縮后的坡度增加,并且越來越接近HFBII的坡度,這再次表明層行為逐漸由HFBII主導(dǎo)。對(duì)此幾乎沒有可能的解釋:(i)WPI在界面上的構(gòu)象變化(HFBII更為剛性),這在純體系中是不存在的,但當(dāng)兩種蛋白質(zhì)混合時(shí)會(huì)以某種方式出現(xiàn)。然而,這是不可能的,否則我們也會(huì)在擴(kuò)散層中看到它的跡象;(ii)界面處的拓?fù)渲嘏?,最初界面?D WPI連續(xù)的,WPI占主導(dǎo)地位,有一些分散的HFBII 2D域。這些域?qū)⒃趬嚎s和擴(kuò)展后逐漸互連,并形成HFBII連續(xù)網(wǎng)絡(luò)(在2D中,雙連續(xù)階段在拓?fù)渖鲜遣豢赡艿模H绻@種情況再次發(fā)生,我們希望在擴(kuò)散層中看到類似的趨勢(shì),但事實(shí)并非如此(或在非常有限的程度上);(iii)由于WPI在界面上的吸附/解吸,界面中蛋白質(zhì)的組成發(fā)生變化,這同樣不太可能,因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)的吸附能都很高,最后(iv)在界面上形成多層結(jié)構(gòu),其中頂層富含HFBII并占主導(dǎo)地位,而底層富含WPI并吸附到頂層。后者可能是因?yàn)榧词笻FBII分子的親水部分仍然含有大量疏水氨基酸,因此也是相對(duì)疏水的,并且由于HFBII和WPI下面的靜電斥力預(yù)計(jì)非常低,因?yàn)镠FBII表面層的等電點(diǎn)接近中性,這是這些系統(tǒng)中的相關(guān)pH值[10]。如果為真,這將給出系統(tǒng)的中間配置狀態(tài),介于WPI在界面處完全吸附和完全解吸之間,具有非常高的能量差。我們還看到混合鋪展層(見圖1)情況下的這種行為相似,但這與體相中沒有WPI的情況不太明顯。


3.3.泡沫實(shí)驗(yàn)環(huán)境和壓力循環(huán)


在前幾段中,我們考慮了HFBII和WPI在空氣/水界面的擴(kuò)散和吸附層。在本節(jié)中,我們?cè)噲D將蛋白質(zhì)在界面上的行為與泡沫的形成和穩(wěn)定性聯(lián)系起來。在這里,當(dāng)我們根據(jù)初始?xì)馀莩叽鐏砻枋雠菽詴r(shí),應(yīng)該注意,初始?xì)馀莩叽缛Q于泡沫性和泡沫穩(wěn)定性(形成后立即),因?yàn)樵跍y(cè)量初始?xì)馀莩叽缰?,泡沫與0.5%黃原膠溶液混合。黃原膠為系統(tǒng)提供了微弱的表觀屈服應(yīng)力,足以阻止奶油化和氣泡再發(fā)酵,因此我們只能研究隨后的粗化過程[8]。


圖8給出了以與圖3相同的HFBII:WPI比率制備的兩種泡沫的初始?xì)馀莩叽?。最重要的觀察結(jié)果是,少量HFBII(來自fHFBII 0.03)在很大程度上影響泡沫的初始?xì)馀莩叽?。此外,似乎從WPI主導(dǎo)向HFBII主導(dǎo)的行為轉(zhuǎn)變發(fā)生在fHFBII~=0.2,對(duì)應(yīng)于朗繆爾槽中吸附層中觀察到的轉(zhuǎn)變(圖6)。

圖3。吸附0.1 mg/ml HFBII和WPI期間的表面壓力與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系;包括第一次壓縮/膨脹循環(huán)(左)和壓縮和膨脹期間吸附的HFBII和WPI層的表面壓力等溫線。

圖8。根據(jù)濁度掃描測(cè)量評(píng)估的環(huán)境充氣泡沫和壓力循環(huán)泡沫的初始?xì)馀莩叽纾ㄓ?.5%黃原膠稀釋后)。


這表明,與鋪展層相比,泡沫中的成分功能性更好地對(duì)應(yīng)于吸附層,這是有道理的,因?yàn)樵谂菽纬善陂g,蛋白質(zhì)層是通過吸附而不是在氣泡表面鋪展形成的,當(dāng)氣泡通過攪拌器攪拌附近的高剪切區(qū)時(shí),蛋白質(zhì)層也會(huì)膨脹和收縮。最后的觀察結(jié)果是,當(dāng)空氣/水界面以HFBII為主時(shí),壓力循環(huán)樣品的初始?xì)馀莩叽缢坪醣任催M(jìn)行壓力循環(huán)的樣品小。


氣泡尺寸隨時(shí)間的相對(duì)增加如圖9所示,表示為d2(t)/d2(0)??紤]到環(huán)境充氣樣品的泡沫穩(wěn)定性,對(duì)于純HFBII系統(tǒng),在本實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)平均氣泡尺寸的顯著變化,表明幾乎不可能發(fā)生任何歧化。在純WPI的情況下,可以發(fā)現(xiàn)氣泡尺寸急劇增加,表明對(duì)歧化的穩(wěn)定性較差。在混合情況下,隨著fHFBII的增加,我們可以看到氣泡尺寸穩(wěn)定性增加的趨勢(shì)。我們可以粗略地說,當(dāng)fHFBII<0.2時(shí),氣泡大小的初始演化在很大程度上取決于WPI。然而,當(dāng)fHFBII>0.2時(shí),HFBII的存在控制泡沫穩(wěn)定性。這與在朗繆爾槽中觀察到的初始?xì)馀荽笮『臀綄拥内厔?shì)非常一致。

圖9。使用TurbirScan根據(jù)氣泡尺寸演變?cè)u(píng)估泡沫穩(wěn)定性


對(duì)于0.03<fHFBII<0.2的泡沫中氣泡尺寸的增加,觀察到在初始粗化數(shù)小時(shí)后,曲線趨于平穩(wěn)。在粗化過程中,小氣泡的收縮和總氣泡中較大氣泡的增長(zhǎng)導(dǎo)致泡沫總表面積的凈減少。上述結(jié)果表明,氣泡穩(wěn)定性隨著表面積的逐漸減小而增加,這與朗繆爾槽上吸附系統(tǒng)在大變形壓縮/膨脹循環(huán)中觀察到的行為一致。


4.結(jié)論


在朗繆爾槽上研究了空氣/水界面上分散和吸附的WPI/HFBII層,其性質(zhì)與泡沫的形成和穩(wěn)定性有關(guān)。在擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)中,觀察到模量隨著表面或亞相中HFBII的分?jǐn)?shù)逐漸增加,我們可以確定WPI主導(dǎo)行為和HFBII主導(dǎo)行為的區(qū)域。通過對(duì)混合表層皺紋的目視觀察,進(jìn)一步證實(shí)了HFBII的優(yōu)勢(shì)。


當(dāng)比較擴(kuò)散和吸附系統(tǒng)時(shí),發(fā)現(xiàn)需要更高的HFBII分?jǐn)?shù)才能在擴(kuò)散層中獲得HFBII主導(dǎo)行為,而不是吸附層(fHFBII分別為0.6和0.2)。此外,我們的結(jié)果表明,與擴(kuò)散層相比,在連續(xù)的大規(guī)模壓縮/膨脹循環(huán)中,吸附層中蛋白質(zhì)的組成會(huì)發(fā)生變化。我們解釋了擴(kuò)散層和吸附層之間的差異,可能在界面處形成雙層/多層,頂層較硬,主要由HFBII控制,底層較軟,主要由WPI控制。這兩層的作用類似于平行連接的粘彈性膜,整體表面性質(zhì)由較強(qiáng)的富HFBII層控制。從真實(shí)泡沫的初始?xì)馀莩叽缂捌淇勾只拈L(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來看,泡沫行為與吸附層中測(cè)量的表面膨脹特性密切相關(guān)。最后,我們觀察到,在HFBII和WPI的混合體系中,粗化過程隨著時(shí)間的推移逐漸趨于平穩(wěn),這進(jìn)一步支持了我們關(guān)于氣泡表面多層形成的假設(shè)。


致謝


作者衷心感謝Jeoffrey Jansen先生對(duì)Turbuscan實(shí)驗(yàn)的幫助。荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)部的魯本·阿諾多夫博士和英國(guó)科爾沃思聯(lián)合利華研發(fā)部的安德魯·考克斯博士因激發(fā)討論而受到認(rèn)可。這項(xiàng)工作由荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)中心弗拉丁根提供資金和執(zhí)行。

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