摘要

我們報道了一項聯(lián)合振動和頻率產(chǎn)生（SFG）光譜、布魯斯特角顯微鏡（BAM）和橢偏儀研究不同表面活性劑在水中作為表面活性劑密度的函數(shù)。在朗繆爾槽中測量了表面活性劑在表面活性劑CH和水OH拉伸區(qū)的振動SFG光譜。在低密度下，表面活性劑存在時產(chǎn)生的SFG信號與清水中產(chǎn)生的SFG信號無法區(qū)分?空中接口。當(dāng)表面活性劑密度增加時，即在壓縮單分子層時，觀察到CH和OH光譜區(qū)域的SFG信號突然增加。對于更高的激光通量，這種逐步增加發(fā)生在表面活性劑密度越來越高的情況下。由于BAM表明，表面活性劑分子在這些低密度下明顯存在，因此我們得出結(jié)論，在低表面活性劑密度下，激光束在液體膨脹相中將相對高密度的區(qū)域與表面活性劑置換出激光聚焦區(qū)域。這是由于在1 kHz的重復(fù)激光激發(fā)下，頂部為單層的水相局部加熱引起的熱梯度的結(jié)果。它可以通過使用旋轉(zhuǎn)槽繞過。通過這種方式，可以刷新采樣的表面積，從而可以將無偽影的振動SFG光譜測量到最低的表面活性劑密度。在橢偏儀實驗中，可以注意到一個類似的步驟，然而，這是一個不同的性質(zhì)；i、例如，它與加熱無關(guān)（激光注量很低，光不共振），而是與分子躍遷有關(guān)。橢偏儀中每一分子面積的函數(shù)步驟的出現(xiàn)，關(guān)鍵取決于單層膜的制備。在制備單分子膜的過程中，通過給分子留出時間和空間使其松弛，也可以消除這一步驟。

介紹

在過去的幾十年中，紅外-可見和頻發(fā)生（SFG）已被證明是研究水相表面活性劑的極好工具。1.?9在該技術(shù)中，紅外激光束與可見激光束在感興趣的界面處組合，并檢測兩者的和頻光束。在中心對稱介質(zhì)中，信號的產(chǎn)生通常是被禁止的，因此對界面上分子的存在非常敏感。如果紅外激光與界面分子的振動躍遷共振，則SFG強度增強，從而可以測量界面分子的振動光譜。SFG光譜的形狀包含有關(guān)表面活性劑的分子構(gòu)象和方向的信息。大多數(shù)研究都集中在高密度單分子膜上，盡管在低密度下有令人驚訝的觀察報告。我們中的一些人（Roke等人4）以前曾報告過C?H不溶性表面活性劑DPPC（1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿；見圖1）在水上的拉伸模式，密度約為100?2/分子，密度間隔小于1?2/分子，這歸因于脂質(zhì)尾部的卷曲和未卷曲。最近，Chen等人9報告了DPPC在水和含有低二甲基亞砜摩爾分數(shù)的水上的CH信號在該密度附近的類似行為。此外，他們報告說，來自DPPC頭部總成的P=O振動信號僅在CH信號存在時出現(xiàn)。他們將CH信號的缺失/存在歸因于DPPC分子的無序/有序尾部。P=O信號的缺失可通過頭部大的取向分布來解釋。

圖1。頂板：DPPC的分子結(jié)構(gòu)。中間面板：裸露水面（底部光譜）和密度增加的水中DPPC的SSP極化SFG光譜。壓力（mN/m）和每個分子的面積（?2）分別從底部到頂部增加和減少，在圖表旁邊給出。每個分子的面積由氯仿溶液滴的數(shù)量控制。CH（2800）?3000厘米?1），氫鍵OH（3000?3600厘米?1），還有免費的哦(～3705厘米?1）拉伸振動可見。底部面板：從裸露水面的中間面板放大，每個分子的DPPC為108?2，以表明它們的相似性。插圖放大了裸露水面和DPPC（100?2）表面的自由OH拉伸振動區(qū)域。在每個分子的這個區(qū)域，壓力仍然低于檢測極限，表面上DPPC的存在顯然不影響自由OH拉伸振動的振幅。相對較高的紅外通量(～10 mJ/cm2）用于本實驗。

雖然這些解釋與數(shù)據(jù)一致，但對于所有模式，脂質(zhì)信號消失可能有些令人驚訝；即使對于脂質(zhì)卷曲的高度無序的單層，對稱性也會被破壞，這僅僅是因為（可能是中心對稱的）脂質(zhì)層兩側(cè)的水和空氣的介電常數(shù)不同。Roke et al.和Chen et al.都是基于C?H和P=O拉伸區(qū)域，即，源自脂質(zhì)的模式。氫鍵水信號以前從未被研究過，它將使人們對觀察到的現(xiàn)象有更多的了解。人們可能會認為，如果密度發(fā)生變化，水信號也有助于理解脂質(zhì)的組織。特別是，這個問題提出了水結(jié)構(gòu)如何受到可能無序脂質(zhì)的影響。水中氫鍵水的信號?如果存在表面活性劑，則空氣界面通常較大，其中水SFG信號的強度取決于表面活性劑的類型。10?12因此，在壓縮脂質(zhì)層時，預(yù)計水帶中會發(fā)生變化。此外，自由OH預(yù)計會在壓縮單層時受到影響，正如之前所看到的自由OD。13在這里，我們同時測量了DPPC單層在不同密度下的表面活性劑和水分子。在傳統(tǒng)的SFG實驗中，樣品庫是固定的，隨著脂質(zhì)密度的增加，光譜會發(fā)生階躍轉(zhuǎn)變，與水的光譜無法區(qū)分?空氣界面到一個具有更強烈的水光譜和CH模式的界面。在水光譜中觀察到的強度階躍與來自表面活性劑的CH信號完全相關(guān)。當(dāng)樣品貯存器連續(xù)移動時，該強度步驟不存在。

通過使用布魯斯特角顯微鏡（BAM），我們將表明，盡管表面活性劑在SFG中是不可見的，但它確實以非常低的密度存在于表面。BAM非常適合于在水面上顯示密度相對較高的表面活性劑區(qū)域。在布魯斯特角(～對于使用HeNe激光器的水，p偏振光的反射消失。然而，如果表面存在表面活性劑或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域，則可以看到它們，因為它們確實在布儒斯特角反射一些光。

在此，我們研究了SFG信號中觀察到的不連續(xù)性在多大程度上是由測量方式引起的。我們發(fā)現(xiàn)，SFG在某些條件下具有侵入性：在低表面活性劑密度（即每分子面積>100?2）下，共振紅外（IR）激光脈沖對水面層的重復(fù)加熱導(dǎo)致高密度表面活性劑區(qū)域因熱梯度誘導(dǎo)的流動而從激光焦點處移位。在較高的平均表面活性劑密度下，激光誘導(dǎo)的熱梯度不再足以使疇遠離激光焦點，信號突然增加。這解釋了先前在低密度下觀察到的單分子膜SFG信號的不連續(xù)性。為了概括我們的結(jié)論，我們表明這種行為不僅在脂質(zhì)單層中觀察到，而且在其他表面活性劑類型中也觀察到。我們研究了一種脂肪酸（棕櫚酸）和一種醇（1-十二醇）。此外，我們還報道了DPPC在低密度水中的真實無創(chuàng)SFG光譜(～300?2/分子）至高密度(～50?2/分子），通過使用旋轉(zhuǎn)槽。這些新結(jié)果顯示SFG信號逐漸增加。

令人驚訝的是，在通過橢偏法獲得的橢圓度系數(shù)中，在低密度下也經(jīng)常觀察到脂質(zhì)和脂肪酸的類似步驟。14?18橢偏儀基本上是BAM的空間整合版本；i、例如，代替二維圖片，獲得橢圓系數(shù)。我們認為，橢偏測量中觀察到的強度階躍與SFG中的階躍具有不同的起源。單分子膜的加熱可以忽略不計，因為在橢偏儀中，激光與水不共振，且通量較低。我們發(fā)現(xiàn)，與SFG相比，橢圓偏振法的步驟取決于樣品制備。通過給分子時間和空間來放松，我們也可以消除這個步驟。

實驗部分

對于SFG實驗，寬帶紅外脈沖（fwhm）為～200厘米?1）由泵送的OPG/OPA（TOPAS，光轉(zhuǎn)換）產(chǎn)生～來自相干Legend激光系統(tǒng)的1 W 800 nm脈沖（1 kHz，～120 fs半高寬）。同時,，～0.5 W的激光輸出通過標(biāo)準具，產(chǎn)生窄帶VIS脈沖（12 490 cm?1.～30μJ，半高寬帶寬～15厘米?1）提供實驗的光譜分辨率。寬帶紅外脈沖允許同時檢測多種振動模式。紅外脈沖的中心是～3100厘米?1(～6μJ）用于檢測CH和氫鍵OH振動的實驗，并且～3700厘米?1(～3μJ）用于游離OH實驗。對于一些實驗，紅外中心頻率在2750到3750厘米之間連續(xù)變化（“掃描”）?1同時測量CH和全OH區(qū)域。從2750到3750再回到2750厘米大約需要一分鐘的時間?1.可見光和紅外光束的入射角分別為，～35°和～相對于表面法線為40°。可見光光束聚焦到約400μm的束腰。在兩次實驗之間改變了紅外焦點。大多數(shù)實驗都是在紅外焦點大小為的情況下進行的～200μm高斯光束束腰，產(chǎn)生～10兆焦耳/平方厘米。對于低通量(～1.5 mJ/cm2）實驗（圖5和圖7，頂部面板），我們移動紅外透鏡，以使樣品處的光束束腰減小～SFG光通過單色儀進行光譜分散，并通過電子倍增電荷耦合器件（EMCCD和或技術(shù)）進行檢測。在單層壓縮過程中，在固定的紅外頻率下，以30秒的采集時間連續(xù)測量SFG光譜。在紅外頻率在2750到3750厘米之間掃描的實驗中，采集時間為6（高通量）或10（低通量）分鐘?1.除非另有說明，否則SFG光譜在s偏振SFG、s偏振VIS和p偏振IR條件（SSP）下記錄，并標(biāo)準化為取自z切割石英的參考光譜。

對于布魯斯特角顯微鏡（BAM），使用配備50 mW 532 nm激光器的自制機器。19 p偏振光在表面上以大約布儒斯特角反射(～53°）并通過顯微鏡接收。由于單層在可視化軸上傾斜，圖像僅聚焦在窄條上。為了獲得足夠大的圖像，然后將通過在單層上不同水平聚焦形成的不同條帶的圖像并排放置。由此獲得了600μm×600μm的大圖像，空間分辨率接近1μm。

使用兩種不同的橢偏儀進行橢偏測量。一個是在布魯斯特角工作的自制偏振調(diào)制機器(～53°），并配備一臺產(chǎn)生5 mW 632 nm光的激光器。另一種是商用零橢偏儀（Optrell），在50°角下以2 mW 632 nm的激光入射。對于橢偏儀和BAM，照明面積均為幾平方毫米。

表面活性劑DPPC（1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）、1-十二醇（C12H25OH）和棕櫚酸（C15H31COOH）分別從Avanti極性脂質(zhì)、Fluka和Sigma-Aldrich中獲得，使用時無需進一步純化。單分子膜從氯仿溶液（DPPC）中擴散～0.5毫米，1-十二醇～3毫米，棕櫚酸～2毫米）在空氣中?H2O（微孔，18MΩcm）界面。通過兩種方法制備具有不同表面密度的單分子膜：通過在水面上散布0.5μL液滴的數(shù)量或通過壓縮該層來控制每個分子的面積。使用商用（芬蘭Kibron Inc.）張力計，使用指針測量表面壓力。由于橢偏測量結(jié)果取決于單層制備的方式，我們?yōu)槊糠N類型的實驗提供了制備的明確描述。

SFG。在我們連續(xù)掃描紅外頻率以立即獲得整個CH和OH光譜的實驗中，使用了自制的7×7 cm2特氟隆涂層槽（圖1和圖7，底部面板）。對于在激光發(fā)射之間（部分）刷新樣品的實驗，使用自制的圓形（直徑8 cm）特氟隆槽（圖5和圖6）。該槽使用一個簡單的12 V直流電動機旋轉(zhuǎn)，該電動機驅(qū)動一個自制的旋轉(zhuǎn)臺，其旋轉(zhuǎn)方式使樣品在激光焦點處以100%的速度移動～0.06 m/s。在這兩種情況下，每個分子的面積由散布在水面上的0.5μL液滴的數(shù)量控制。對于要求每個分子的面積具有高分辨率的實驗（圖2），我們使用了6×23 cm的商用金屬朗繆爾槽（芬蘭Kibron公司）。用一個速度在5至10 mm/min之間的屏障壓縮該層(～1.3?2.6?2/鏈/分鐘）。每個分子的初始面積由表面活性劑氯仿溶液中0.5μL液滴的數(shù)量控制。

圖2。（a）DPPC的CH信號（綠色）、氫鍵OH信號（藍色）和自由OH信號（紅色）的表面壓力（黑色，左軸）和積分SFG強度（右軸），作為連續(xù)壓縮單層過程中每個分子面積的函數(shù)。為了清晰起見，集成SFG信號被歸一化，并且彼此之間具有小偏移。集成光譜區(qū)域由插圖中的彩色正方形標(biāo)記，分別顯示CH/OH鍵合和游離OH區(qū)域中每個分子50和100?2的SFG光譜。相對較高的紅外通量(～已使用10 mJ/cm2）。（b）與（a）類似，但紅外功率降低了四倍，導(dǎo)致通量降低了四倍(～2.5 mJ/cm2）。插圖顯示了改變紅外注量對SFG信號出現(xiàn)的每個分子面積的影響。（c）類似于（a），但適用于棕櫚酸。（d）類似于（a），但對于1-十二醇。在這種情況下，未測量1-十二醇的游離OH。SFG結(jié)果是在SSP極化下獲得的。

砰。在布魯斯特角顯微鏡（BAM）實驗（圖3）中，使用了面積為324 cm2的聚四氟乙烯槽。在沉積液滴后，每個分子的面積為150?2，通過用一個屏障壓縮單層來控制層的密度。在一定密度下，停止屏障以收集圖像。

圖3。水上不同密度DPPC的布儒斯特角顯微鏡圖像。圖像大小為600×600μm。白色區(qū)域表示高密度，而黑色區(qū)域表示低密度。在每個面板中，每個分子的面積（單位為?2）在左下角報告，表面壓力（單位為mN/m）在右下角報告。這些照片是用自動調(diào)整靈敏度的相機拍攝的，這樣就無法比較圖像之間的灰度等級。

橢偏儀。在一組實驗中，在最初沉積氯仿溶液液滴后，通過在6×23 cm的商用金屬朗繆爾槽（Kibron Inc.，芬蘭）中以5 mm/min的速度壓縮該層，并使用一個屏障（圖8a和8c）來控制表面積。在另一個實驗中，每個分子的面積由在自制的圓形（直徑8 cm）特氟隆涂層槽（圖8b）中水面上散布的0.5μL液滴數(shù)量控制。如下所示，對于以不同方式制備的單分子膜，可以獲得不同的結(jié)果。