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牡蠣低分子肽LOPs雙重乳液制備、界面性質(zhì)檢測及消化吸收特性研究(四)
來源:食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報 瀏覽 56 次 發(fā)布時間:2025-07-07
2.3 LOPs及其雙重乳液體外模擬吸收與轉(zhuǎn)運特性分析
2.3.1 LOPs及其雙重乳液對Caco-2細(xì)胞毒性分析
LOPs及其雙重乳液對Caco-2細(xì)胞的毒性,實驗結(jié)果見圖8。由圖8(a)可知,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%、0.50%和3.00%的LOPs未能促進(jìn)Caco-2細(xì)胞生長;當(dāng)LOPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過6.00%時,細(xì)胞存活率極低,推測此質(zhì)量分?jǐn)?shù)的LOPs對細(xì)胞的滲透壓過高或過量的物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡;當(dāng)LOPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%~2.50%時,細(xì)胞存活率(相對于無LOPs培養(yǎng)液對照組)均無顯著性差異,出現(xiàn)這類情況可能是由于,LOPs是含有各種氨基酸的多肽,添加了特定濃度的LOPs可能在一定程度上比常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液促進(jìn)了Caco-2的生長。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs,在BL側(cè)可測得透過的LOPs含量在檢測的合適范圍,因此選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs進(jìn)行后續(xù)實驗。由圖8(b)可知,LOPs的雙重乳液對Caco-2細(xì)胞的存活率的影響隨著乳液稀釋倍數(shù)的提高而不斷上升,這可能與雙重乳液中的乳化劑和大豆油對細(xì)胞具有一定的毒性有關(guān)。稀釋倍數(shù)過低的雙重乳液還可能對細(xì)胞產(chǎn)生高滲透作用,若LOPs雙重乳液的稀釋倍數(shù)過高,所含LOPs濃度過低,無法達(dá)到后續(xù)轉(zhuǎn)運實驗的條件。因此,綜合實驗結(jié)果,選用具有較高Caco-2細(xì)胞存活率的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.00%的LOPs、100倍稀釋處理的LOPs雙重乳液進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)運實驗。
不同小寫字母表示各組數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P<0.05)。
圖8 LOPs及LOPs雙重乳液對Caco-2細(xì)胞的毒性
2.3.2單層Caco-2細(xì)胞模型的驗證
2.3.2.1 TEER的測定
單層Caco-2細(xì)胞模型的完整性和致密性可以通過TEER進(jìn)行評估。一般情況下,認(rèn)為當(dāng)單層細(xì)胞的TEER高于300Ω·cm2時,單層Caco-2細(xì)胞就可以用于進(jìn)一步的實驗。圖9為不同初始密度的單層Caco-2細(xì)胞兩側(cè)的跨膜電阻隨培養(yǎng)時間的變化情況。由圖9可知,整個實驗周期,單層Caco-2細(xì)胞的初始接種密度對最終電阻的影響不大。前期細(xì)胞跨膜電阻變化緩慢,培養(yǎng)9 d后,跨膜電阻出現(xiàn)大幅度增長,在培養(yǎng)17 d后的電阻趨于穩(wěn)定,最后的電阻穩(wěn)定于375Ω·cm2附近,表明單層Caco-2細(xì)胞模型具有中度緊密度。
圖9 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)過程中的TEER
2.3.2.2堿性磷酸酶活性的測定
Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后的堿性磷酸酶活性見圖10。由圖10(a)、(b)可以發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)3 d過程中,單層Caco-2細(xì)胞生長穩(wěn)定并均勻分布在Transwell上,貼壁情況良好。堿性磷酸酶AKP是小腸刷狀緣細(xì)胞的標(biāo)志酶,其濃度代表了單層Caco-2細(xì)胞的極化和功能。觀察圖10(c)可知,培養(yǎng)21 d后,不同接種細(xì)胞密度在AP側(cè)的酶活性均高于BL側(cè)的酶活性,屬正常的細(xì)胞極化結(jié)果。初始密度為3×105個/mL的細(xì)胞AP側(cè)的AKP活性高于其他兩組,其BL側(cè)的AKP活性低于其他兩組,證明該組細(xì)胞分化情況較好。隨著細(xì)胞密度的增大,AP側(cè)與BP側(cè)活力的比值呈下降趨勢,說明初始細(xì)胞密度過大不利于細(xì)胞的分化。實驗結(jié)果表明,3種模型細(xì)胞均生長良好。
光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)為10×40;不同小寫字母表示AP側(cè)的組間數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05),不同大寫字母表示BL側(cè)的組間數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)。
圖10 Caco-2細(xì)胞的生長狀態(tài)及培養(yǎng)21 d后堿性磷酸酶的活性
2.3.2.3熒光素鈉透過率測定
標(biāo)記物跨膜通量的測定也可以反映單層細(xì)胞膜的完整性,熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線及其在不同時間段的透過率見圖11。由圖11(a)的熒光素鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中,代入BL側(cè)的吸光度,可計算出BL側(cè)的熒光素鈉質(zhì)量,根據(jù)式(4),即可得出不同時間段的熒光素鈉透過率[圖11(b)]。由圖11(b)可知,孵育2 h后,3個不同初始密度的細(xì)胞模型均對熒光素鈉具有一定的透過性。初始細(xì)胞密度為3×105個/mL的細(xì)胞模型對熒光素鈉的透過率相對較高,達(dá)到13.96%;初始AP側(cè)加入熒光素鈉的密度為20μg/mL,最終3種模型的熒光素鈉透過量均小于0.011 6μg/min,說明3種細(xì)胞模型單層膜的致密性能良好。
圖11熒光素鈉標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線及其透過率
本實驗比較了3種初始細(xì)胞密度培養(yǎng)的細(xì)胞模型,3種模型的Caco-2細(xì)胞與細(xì)胞之間連接緊密,均具有良好的致密性和完整性,且已極性分化,表明已成功構(gòu)建了單層Caco-2細(xì)胞模型,3種密度的細(xì)胞模型均可用于跨膜轉(zhuǎn)運吸收實驗。
2.3.3 LOPs及其雙乳液的轉(zhuǎn)運方式分析
藥物或營養(yǎng)物質(zhì)通過單層Caco-2細(xì)胞模型的表觀滲透系數(shù)(Papp)與其體內(nèi)吸收具有良好的相關(guān)性。現(xiàn)行國際物質(zhì)運輸判斷標(biāo)準(zhǔn):Papp值高于1×10-5 cm/s,吸收率在70%~100%,表明吸收良好;Papp值為1.0×10-6~1.0×10-5 cm/s,表現(xiàn)出吸收率為20%~70%,表明吸收適中;Papp值<1.0×10-6 cm/s,表現(xiàn)吸收率為0~20%,表明吸收不良。此外,Papp(BL-AP)與Papp(AP-BL)的比值(流出比)是藥物遞送行為的重要指標(biāo),如果比值小于0.5,則表明主要運輸方式是外流效應(yīng),比值在0.5~1.8,則說明主要轉(zhuǎn)運機(jī)制為被動擴(kuò)散,比值大于1.8,說明主要運輸方式是主動運輸。根據(jù)本研究結(jié)果,我們將3種初始密度不同的單層Caco-2細(xì)胞模型均用于模擬吸收實驗,分析結(jié)果見圖12。由圖12(a)和圖12(b)可知,3種模型的Rapp值均高于1×10-5 cm/s,實驗結(jié)果表明,單層Caco-2細(xì)胞對LOPs及其雙重乳液的吸收良好。由圖12(c)可知,LOPs的流出比約為0.7,LOPs雙重乳液的流出比約為0.3,說明LOPs的轉(zhuǎn)運方式為被動擴(kuò)散,LOPs雙重乳液的轉(zhuǎn)運機(jī)制為外流效應(yīng)。然而,相比于LOPs的流出比,LOPs雙重乳液的流出比較小,說明雙重乳液對LOPs存在緩釋作用。
圖(a)和圖(b)中,不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間表觀滲透系數(shù)存在顯著差異(P<0.05),圖(c)中,不同大寫、小寫字母分別表示LOPs、LOPs雙重乳液的組間流出比存在顯著差異(P<0.05)。
圖12 LOPs及其雙重乳液的滲透系數(shù)及流出比
3結(jié)論
本研究基于LOPs的界面性質(zhì),分析包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液的體外模擬消化與吸收特性。研究結(jié)果表明,LOPs具有強(qiáng)親水性,但不具有降低油水間界面張力的能力,不具備乳化特性,需添加相應(yīng)乳化劑以穩(wěn)定構(gòu)建包封LOPs的W1/O/W2雙重乳液。體外模擬消化吸收實驗結(jié)果表明:LOPs雙重乳液經(jīng)模擬口腔、胃消化及小腸消化,整個消化過程乳液粒徑呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢,LOPs的包封率隨之下降;LOPs雙重乳液在胃部酸環(huán)境下發(fā)生聚集,而后到達(dá)腸道消化階段因雙重結(jié)構(gòu)被小腸消化酶降解破裂釋放出大部分的LOPs,表明雙重乳液結(jié)構(gòu)對LOPs具有一定的保護(hù)及緩釋作用。采用單層Caco-2細(xì)胞模型模擬體外吸收實驗,結(jié)果顯示:單層Caco-2細(xì)胞對LOPs及其雙重乳液的吸收特性良好,其中,LOPs以被動擴(kuò)散的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)運,而LOPs雙重乳液的轉(zhuǎn)運方式為外流效應(yīng);LOPs雙重乳液的流出比小于LOPs的流出比,說明雙重乳液的包封作用對LOPs具有一定的延長吸收及長效作用。研究結(jié)果旨在為闡明包封水溶性生物活性肽的W1/O/W2型雙重乳液的消化、吸收及轉(zhuǎn)運機(jī)制提供一定參考。