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基于微量天平測定人血白蛋白辛酸鈉含量

來源:生物化工 瀏覽 933 次 發(fā)布時間:2024-10-10

人血白蛋白在臨床上主要用于失血創(chuàng)傷、燒傷引起的休克以及腦水腫和損傷引起的顱壓升高等的治療。人血白蛋白制品中加入適量的辛酸鈉,可以保證制品的穩(wěn)定性,但是辛酸鈉有很多生物學(xué)作用,如引起低血糖癥,對各類動物有麻醉作用,增加氧的消耗,降低肝臟對長鏈脂肪酸的清除作用,血管舒張作用以及降低肌肉收縮力等作用[1]?!吨腥A人民共和國藥典》三部(2020年版)[2]中規(guī)定,人血白蛋白辛酸鈉含量為“每1 g蛋白質(zhì)中應(yīng)為0.140~0.180 mmol”。筆者長期使用該方法發(fā)現(xiàn),該方法重復(fù)性不理想,容易出現(xiàn)實驗室偏差。經(jīng)分析,出現(xiàn)偏差的原因可能是4 mL三氯甲烷揮干后,再加100μL三氯甲烷溶解殘渣不完全,進樣溶液濃度不能代表供試品溶液濃度,因此筆者擬刪去藥典中辛酸鈉含量測定方法中的“將三氯甲烷揮發(fā)至干,另加三氯甲烷100μL溶解殘渣”,即不揮發(fā)至干直接進樣,開展人血白蛋白辛酸鈉含量測定(氣相色譜法),對優(yōu)化前、后的方法進行對比研究,進一步提升檢驗的效率和水平。


1材料與方法


1.1儀器與設(shè)備


GC-2010Plus氣相色譜儀(配FID檢測器);BP21色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 um);CPA225D電子微量天平


1.2藥品與試劑


辛酸標準品(批號6827100),純度99.5%,美國CHEM-SERVICE公司;庚酸標準品(批號6415900),純度99.5%,美國CHEM-SERVICE公司;高氯酸(批號20150701),色譜純,天津政成化學(xué)制品有限公司;三氯甲烷(批號20160106-2),分析純,廣州化學(xué)試劑廠;人血白蛋白供試品(10 g/瓶,批號20180712、20180813、20180814、20180815、20180916、20181017),廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司;人血白蛋白質(zhì)控品(批號20170421-3),廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司;每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標回收率溶液,廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司。


1.3試驗方法


1.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗


用酸改性聚乙二醇毛細管柱(20 m),柱溫160℃,火焰離子化檢測器,檢測器溫度230℃,氣化室溫度230℃,載氣(氮氣)流速為35 mL/min。


辛酸峰與庚酸峰的分離度應(yīng)大于1.5,辛酸峰的拖尾因子應(yīng)為0.95~1.20,辛酸對照品溶液連續(xù)進樣5次,所得辛酸峰與庚酸峰面積之比的相對標準偏差應(yīng)不大于5%。


1.3.2內(nèi)標溶液的制備


取庚酸,加三氯甲烷制成每l mL三氯甲烷中含10 mg庚酸的溶液,即得。


1.3.3測定方法


取供試品,用水準確稀釋成蛋白質(zhì)含量為40~50 g/L的溶液,即為供試品溶液。精密量取供試品溶液0.5 mL,加內(nèi)標溶液30μL與1.5 mol/L高氯酸溶液0.2 mL,于振蕩器上混合1 min,加三氯甲烷4 mL,加蓋,于振蕩器上劇烈混合2 min,以3 000 r/min離心20 min,除去上層水相,小心將三氯甲烷層傾入10 mL試管中,取0.1μL注入氣相色譜儀。


另精密稱取辛酸對照品0.15 g,置于10 mL容量瓶中,用三氯甲烷溶解并稀釋至刻度,即為辛酸對照品溶液。精密量取辛酸對照品溶液10μL、20μL、30μL、40μL和50μL,分別精密加內(nèi)標溶液30μL,于振蕩器上混合1 min,加三氯甲烷4 mL,同法操作。以各辛酸對照品溶液峰面積與內(nèi)標溶液峰面積比對各辛酸對照品溶液辛酸量(μg)作直線回歸,求得直線回歸方程,并計算出供試品溶液辛酸絕對量及供試品辛酸鈉含量。


1.3.4重復(fù)性試驗


取人血白蛋白質(zhì)控品(批號20170421-3)作為供試品,重復(fù)測定6次,根據(jù)標準曲線計算辛酸鈉含量。


1.3.5加標回收率試驗


取每1 g蛋白質(zhì)中含0.130 mmol、0.160 mmol、0.190 mmol辛酸鈉的加標回收率溶液作為供試品,每個濃度分別制備3份進行測定,根據(jù)標準曲線計算辛酸鈉含量。


2結(jié)果與分析


2.1系統(tǒng)適用性圖譜峰面積的變化


由表1可知,不揮干,直接進樣法(優(yōu)化后的方法)所得峰面積較小,這是因為優(yōu)化后方法的辛酸對照品溶液不揮發(fā)至干,直接進樣使得濃度變低,峰面積變小,但不影響積分。連續(xù)5針辛酸峰與庚酸峰面積之比的RSD值由藥典方法的0.1%變?yōu)?.0%,但仍符合系統(tǒng)適用性要求(不大于5%)。實驗時間由2 d縮短為1 d。

表1系統(tǒng)適用性結(jié)果


2.2重復(fù)性試驗比較


由表2可知,方法優(yōu)化前、后的重復(fù)性試驗RSD值分別為4%、2%。對兩組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗,F(xiàn)=1.108,P=0.317>0.05,方差具有齊性,即兩組數(shù)據(jù)精密度無顯著性差異,表明進樣濃度降低并不影響實驗結(jié)果的精密度。

表2重復(fù)性試驗結(jié)果(n=6)


2.3加標回收率試驗比較


由表3可知,藥典方法測得的9次回收率的平均值為97.7%,RSD值為1.70%;不揮干,直接進樣法測得的9次回收率的平均值為99.7%,RSD值為1.55%。對兩組數(shù)據(jù)進行單因素方法分析,F(xiàn)=7.530,P=0.02<0.05,兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異。方法優(yōu)化后準確度更接近100%,這是因為優(yōu)化后的方法不受揮干速度的影響[3],進樣溶液比藥典方法均勻,損失量相對較小。

表3回收率試驗結(jié)果


2.4樣品含量測定


應(yīng)用優(yōu)化后的人血白蛋白辛酸鈉含量測定方法,對廣東衛(wèi)倫生物制藥有限公司生產(chǎn)的6批人血白蛋白(10 g/瓶)進行辛酸鈉含量測定,結(jié)果見表4。各批次人血白蛋白中辛酸鈉含量均符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定,辛酸鈉含量的平均值為0.161 mmol/g蛋白,RSD值為2%,與理論投料量0.160 mmol/g蛋白較接近。

表4樣品含量測定結(jié)果(n=6)


3結(jié)論


本研究優(yōu)化后的方法不需要將三氯甲烷揮干后再加100μL三氯甲烷溶解殘渣,縮短了試驗時間,減少了揮發(fā)的三氯甲烷對人和環(huán)境的影響。結(jié)果證明,優(yōu)化后的方法重復(fù)性好,準確度較高,適用于人血白蛋白辛酸鈉含量測定。


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